一种天然游离态虾青素的高效制备及纯化方法

本发明涉及虾青素技术领域，具体涉及一种天然游离态虾青素的高效制备及纯化方法。

背景技术：

虾青素(astaxanthin，3,3'-二羟基-4,4-二酮基-β,β'-胡萝卜素)，是一种红色酮式类胡萝卜素，发现于某些水生动物体内。据报道，虾青素的抗氧化性比β-胡萝卜素高10倍以上，比维生素e高500倍以上，被称为“超级维生素e”。虾青素可作为着色剂应用于贵重水产品及禽类养殖以增加其附加商品值，此外，人体也可选择性积累虾青素，有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病等功效。因此近年来受到广泛关注。

在自然界中，虾青素主要以虾青素酯的形式存在，天然虾青素的获得主要是通过对虾青素酯进行水解而制得，传统的水解方法有皂化法，利用强碱将虾青素酯的脂肪酸链水解掉，但是该工艺用碱量大，易造成环境污染，同时，皂化得到的虾青素在碱性环境下极易氧化成虾红素，产生副产物。因此亟待开发一种适用于工业化生产的游离态虾青素的高效制备及纯化技术。

技术实现要素：

针对传统皂化法用碱量大，造成环境污染，易产生副产物的问题，本发明提供一种天然游离态虾青素的制备及纯化方法，本方法简单易操作、成本低、条件温和、环保，最终制得的产品中游离态虾青素的含量达60％以上，能有效避免虾青素在酶解与富集过程中副产物的生成。

一种天然游离态虾青素的制备及纯化方法，所述制备及纯化方法包括如下步骤：

(1)原料及预处理：以雨生红球藻油为原料，向其中加入无水乙醇，充分搅拌混合均匀，得到雨生红球藻油预处理液；

(2)构建雨生红球藻酶解体系：将脂肪酶和抗氧化剂分散于去离子水和/或缓冲液中，然后将含脂肪酶和抗氧化剂的去离子水和/或缓冲液体系加入到步骤(1)得到的雨生红球藻预处理液中，得到雨生红球藻油酶解体系；

(3)一次酶解：将步骤(2)得到的雨生红球藻油酶解体系进行酶解处理，酶解结束后得到雨生红球藻油一次酶解处理液；

(4)一次富集：①将尿素溶于乙醇溶液中，配制尿素乙醇溶液；

②将步骤(3)得到的雨生红球藻油一次酶解处理液与尿素乙醇溶液迅速混合，然后静置；

③静置结束后，将体系迅速过滤和/或离心，收集清液，向清液中加入1～10倍的去离子水，并调节体系ph至6.0～7.0；

(5)二次酶解：向上述步骤③所得富集溶液中加入脂肪酶、抗氧化剂，充分搅拌溶解后进行酶解处理，酶解结束后得到雨生红球藻油二次酶解处理液；

(6)二次富集：将步骤(5)酶解后的雨生红球藻油二次酶解处理液中加入二氯甲烷溶液，充分混合后分层，收集有机相水洗，减压蒸馏得到浓缩物，向所述浓缩物中加入正己烷，充分搅拌溶解后静置，收集沉淀物，干燥，即得到天然游离态虾青素。

进一步的，所述步骤(1)无水乙醇的添加量为雨生红球藻油质量的0％～30％。

进一步的，所述步骤(2)脂肪酶为脂肪酶粉，所述脂肪酶粉直接使用或进行固定化后再使用；所述抗氧化剂为茶多酚、抗坏血酸、乙二胺四乙酸钠、异抗坏血酸及其盐、植酸中的一种或几种。

进一步的，所述步骤(2)脂肪酶的添加量占总酶解体系的质量分数为1％～5％，抗氧化剂的添加量占总酶解体系的质量分数为0.005％～1％，去离子水和/或磷酸盐缓冲液用量占总酶解体系的30％～80％。

进一步的，所述步骤(3)的酶解条件为于35～55℃水浴下进行酶解处理，酶解时间为1～8h，过程进行连续的剪切乳化，剪切乳化的转速为3000～20000rpm，同时过程中不间断的通入氮气。

进一步的，所述步骤(4)包括：①将尿素溶于乙醇溶液中，经加热回流处理，使其充分溶解；尿素占乙醇溶液的质量体积分数为7％～14％；其中乙醇溶液为质量体积分数不低于90％的乙醇水溶液；

②将步骤(3)得到的雨生红球藻油一次酶解处理液与上述步骤①得到的尿素乙醇溶液迅速混合，使总体系中雨生红球藻油与尿素的比例为1：0.5～10，充分搅拌混匀，然后置于-15～25℃环境中静置2～12h；

③静置结束后，将体系迅速过滤和/或离心，收集清液，向清液中加入1～10倍的去离子水，并调节体系ph至6.0～7.0。

进一步的，所述步骤(5)的酶解条件为于35～55℃水浴下进行酶解处理，酶解时间为1～8h，过程进行连续剪切乳化，剪切乳化的转速为3000～20000rpm，同时过程中不间断的通入氮气。

进一步的，所述步骤(5)脂肪酶为脂肪酶粉，所述脂肪酶粉直接使用或进行固定化后再使用；所述抗氧化剂为茶多酚、抗坏血酸、乙二胺四乙酸钠、异抗坏血酸及其盐、植酸中的一种或几种。

进一步的，所述步骤(5)脂肪酶的添加量占总酶解体系的质量分数为0.1％～3％，抗氧化剂的添加量占总酶解体系的质量分数为0.005％～1％。

进一步的，所述步骤(6)包括：将步骤(5)酶解后的雨生红球藻油二次酶解处理液中加入0.5～1倍体积的二氯甲烷溶液，充分混合后分层，收集有机相，然后用去离子水洗涤有机相1～3次，再将有机相进行减压蒸馏至无馏分，得到浓缩物，

向得到的浓缩物中加入0.5～5倍体积的正己烷，在30～50℃条件下充分搅拌溶解，然后置于-5～10℃环境下静置1～12h，收集沉淀物，干燥，即得到天然游离态虾青素。

本发明的有益效果在于，

(1)采用双酶解协同双异相富集的方法，高效得实现了雨生红球藻油中总虾青素的富集和虾青素酯的酯解转化，本发明最终制备得到的产品中游离态虾青素的含量达60％以上，较好的满足了产品的应用过程中的剂量需求；

(2)本发明在制备过程中使用抗氧化剂和氮气联合作用，避免了虾青素在酶解与富集过程中副产物的生成；

(3)本发明的制备方法简单易操作、成本低、条件温和，不改变虾青素的生理活性，适合大规模工业化推广；

(4)本发明得到的天然游离态虾青素可广泛用于化工产品、日化用品、药品、食品及保健品等行业，市场前景广阔。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一种天然游离态虾青素的制备及纯化方法的流程图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种天然游离态虾青素的制备及纯化方法，包括如下步骤：

(1)原料及预处理：以雨生红球藻油为原料，向其中加入无水乙醇，无水乙醇的添加量为雨生红球藻油质量的5％，充分搅拌混合均匀，得到雨生红球藻油预处理液；

(2)构建雨生红球藻酶解体系：将脂肪酶粉和茶多酚分散于去离子水中，然后加入到步骤(1)得到的雨生红球藻预处理液中，得到雨生红球藻油酶解体系；

脂肪酶粉的添加量占总酶解体系的质量分数为1.5％，抗氧化剂的添加量占总酶解体系的质量分数为0.01％，去离子水用量占总酶解体系的质量分数为35％；

(3)一次酶解：将步骤(2)得到的雨生红球藻油酶解体系进行酶解处理，酶解条件为于37℃水浴下进行酶解处理，酶解时间为2.5h，过程进行连续剪切乳化，剪切乳化的转速为5000rpm，同时过程中不间断的通入氮气，酶解结束后得到雨生红球藻油一次酶解处理液；

(4)一次富集：①将尿素溶于乙醇溶液中，经加热回流处理，使其充分溶解；尿素占乙醇溶液的质量体积分数为8％；其中乙醇溶液为质量体积比90％的乙醇水溶液；

②将步骤(3)得到的雨生红球藻油一次酶解处理液与上述步骤①得到的尿素乙醇溶液迅速混合，使总体系中雨生红球藻油与尿素的比例为1：1，充分搅拌混匀，然后置于-10℃环境中静置3h；

③静置结束后，将体系迅速过滤，收集清液，向清液中加入2倍的去离子水，并调节体系ph至6.0；

(5)二次酶解：向上述步骤③所得富集溶液中加入脂肪酶粉、抗坏血酸和乙二胺四乙酸钠，脂肪酶粉的添加量占总酶解体系的质量分数为0.5％，抗氧化剂的添加量占总酶解体系的质量分数为0.01％，充分搅拌溶解后进行酶解处理，酶解条件为于37℃水浴下进行酶解处理，酶解时间为2.5h，过程进行连续剪切乳化，剪切乳化的转速为5000rpm，同时过程中不间断的通入氮气，酶解结束后得到雨生红球藻油二次酶解处理液；

(6)二次富集：将步骤(5)酶解后的雨生红球藻油二次酶解处理液中加入0.5倍体积的二氯甲烷溶液，充分混合后分层，收集有机相，然后用去离子水洗涤有机相1次，再将有机相进行减压蒸馏至无馏分，得到浓缩物，向得到的浓缩物中加入1倍体积的正己烷，在35℃条件下充分搅拌溶解，然后置于0℃环境下静置2h，收集沉淀物，干燥，即得到天然游离态虾青素。

实施例2

一种天然游离态虾青素的制备及纯化方法，包括如下步骤：

(1)原料及预处理：以雨生红球藻油为原料，向其中加入无水乙醇，无水乙醇的添加量为雨生红球藻油质量的25％，充分搅拌混合均匀，得到雨生红球藻油预处理液；

(2)构建雨生红球藻酶解体系：将脂肪酶粉、乙二胺四乙酸钠和异抗坏血酸分散于ph6.8的磷酸盐缓冲溶液中，然后加入到步骤(1)得到的雨生红球藻预处理液中，得到雨生红球藻油酶解体系；

脂肪酶粉的添加量占总酶解体系的质量分数为4％，抗氧化剂的添加量占总酶解体系的质量分数为0.8％，缓冲液用量占总酶解体系的质量分数为70％；

(3)一次酶解：将步骤(2)得到的雨生红球藻油酶解体系进行酶解处理，酶解条件为于50℃水浴下进行酶解处理，酶解时间为6h，过程进行连续剪切乳化，剪切乳化的转速为18000rpm，同时过程中不间断的通入氮气，酶解结束后得到雨生红球藻油一次酶解处理液；

(4)一次富集：①将尿素溶于乙醇溶液中，经加热回流处理，使其充分溶解；尿素占乙醇溶液的质量体积分数为12％；其中乙醇溶液为质量体积比90％的乙醇水溶液；

②将步骤(3)得到的雨生红球藻油一次酶解处理液与上述步骤①得到的尿素乙醇溶液迅速混合，使总体系中雨生红球藻油与尿素的比例为1：8，充分搅拌混匀，然后置于10℃环境中静置10h；

③静置结束后，将体系迅速过滤、离心，收集清液，向清液中加入7倍的去离子水，并调节体系ph至7.0；

(5)二次酶解：向上述步骤③所得富集溶液中加入脂肪酶粉、茶多酚，脂肪酶粉的添加量占总酶解体系的质量分数为2％，茶多酚的添加量占总酶解体系的质量分数为0.8％，充分搅拌溶解后进行酶解处理，酶解条件为于50℃水浴下进行酶解处理，酶解时间为6h，过程进行连续剪切乳化，剪切乳化的转速为18000rpm，同时过程中不间断的通入氮气，酶解结束后得到雨生红球藻油二次酶解处理液；

(6)二次富集：将步骤(5)酶解后的雨生红球藻油二次酶解处理液中加入1倍体积的二氯甲烷溶液，充分混合后分层，收集有机相，然后用去离子水洗涤有机相3次，再将有机相进行减压蒸馏至无馏分，得到浓缩物，向得到的浓缩物中加入4倍体积的正己烷，在50℃条件下充分搅拌溶解，然后置于10℃环境下静置12h，收集沉淀物，干燥，即得到天然游离态虾青素。

实施例3

一种天然游离态虾青素的制备及纯化方法，包括如下步骤：

(1)原料及预处理：以雨生红球藻油为原料，向其中加入无水乙醇，无水乙醇的添加量为雨生红球藻油质量的15％，充分搅拌混合均匀，得到雨生红球藻油预处理液；

(2)构建雨生红球藻酶解体系：将脂肪酶粉和异抗坏血酸分散于ph6.8的磷酸盐缓冲溶液中，然后加入到步骤(1)得到的雨生红球藻预处理液中，得到雨生红球藻油酶解体系；

脂肪酶粉的添加量占总酶解体系的质量分数为3％，抗氧化剂的添加量占总酶解体系的质量分数为0.5％，缓冲液用量占总酶解体系的质量分数为55％；

(3)一次酶解：将步骤(2)得到的雨生红球藻油酶解体系进行酶解处理，酶解条件为于45℃水浴下进行酶解处理，酶解时间为5h，过程进行连续剪切乳化，剪切乳化的转速为12000rpm，同时过程中不间断的通入氮气，酶解结束后得到雨生红球藻油一次酶解处理液；

(4)一次富集：①将尿素溶于乙醇溶液中，经加热回流处理，使其充分溶解；尿素占乙醇溶液的质量体积分数为10％；其中乙醇溶液为质量体积比90％的乙醇水溶液；

②将步骤(3)得到的雨生红球藻油一次酶解处理液与上述步骤①得到的尿素乙醇溶液迅速混合，使总体系中雨生红球藻油与尿素的比例为1：5，充分搅拌混匀，然后置于0℃环境中静置6h；

③静置结束后，将体系迅速离心，收集清液，向清液中加入5倍的去离子水，并调节体系ph至6.0；

(5)二次酶解：向上述步骤③所得富集溶液中加入脂肪酶粉、植酸，脂肪酶粉的添加量占总酶解体系的质量分数为1.2％，植酸的添加量占总酶解体系的质量分数为0.5％，充分搅拌溶解后进行酶解处理，酶解条件为于45℃水浴下进行酶解处理，酶解时间为5h，过程进行连续剪切乳化，剪切乳化的转速为12000rpm，同时过程中不间断的通入氮气，酶解结束后得到雨生红球藻油二次酶解处理液；

(6)二次富集：将步骤(5)酶解后的雨生红球藻油二次酶解处理液中加入0.75倍体积的二氯甲烷溶液，充分混合后分层，收集有机相，然后用去离子水洗涤有机相2次，再将有机相进行减压蒸馏至无馏分，得到浓缩物，向得到的浓缩物中加入2.5倍体积的正己烷，在40℃条件下充分搅拌溶解，然后置于5℃环境下静置5h，收集沉淀物，干燥，即得到天然游离态虾青素。

对比例1

一种天然游离态虾青素的制备及纯化方法，包括如下步骤：

(1)原料及预处理：以雨生红球藻油为原料，向其中加入无水乙醇，无水乙醇的添加量为雨生红球藻油质量的15％，充分搅拌混合均匀，得到雨生红球藻油预处理液；

(2)构建雨生红球藻酶解体系：将脂肪酶粉和异抗坏血酸分散于ph6.8的磷酸盐缓冲溶液中，然后加入到步骤(1)得到的雨生红球藻预处理液中，得到雨生红球藻油酶解体系；

脂肪酶粉的添加量占总酶解体系的质量分数为3％，抗氧化剂的添加量占总酶解体系的质量分数为0.5％，缓冲液用量占总酶解体系的质量分数为55％

(3)单次酶解：将步骤(2)得到的雨生红球藻油酶解体系进行酶解处理，酶解条件为于45℃水浴下进行酶解处理，酶解时间为5h，过程进行连续剪切乳化，剪切乳化的转速为12000rpm，同时过程中不间断的通入氮气，酶解结束后得到雨生红球藻油酶解处理液；

(4)单次富集：将步骤(3)得到的雨生红球藻油酶解处理液中加入0.75倍体积的二氯甲烷溶液，充分混合后分层，收集有机相，然后用去离子水洗涤有机相2次，再将有机相进行减压蒸馏至无馏分，得到浓缩物，向得到的浓缩物中加入2.5倍体积的正己烷，在40℃条件下充分搅拌溶解，然后置于5℃环境下静置5h，收集沉淀物，干燥，即得到天然游离态虾青素。

将实施例3和对比例1制得的游离态虾青素的得率和纯度进行分析，试验结果如表1所示。

游离态虾青素得率按如下公式计算：

其中：m1表示最终制得的天然游离态虾青素产品中游离虾青素的量，g；m0表示原料中总虾青素的量，g。

虾青素的纯度按如下公式计算：

其中：m1表示最终制得的天然游离态虾青素产品中游离虾青素的量，g；m2表示最终制得的天然游离态虾青素产品中总虾青素的量，g。

表1实施例3和对比例1制得的天然游离态虾青素试验数据表

试验结果表明，实施例3制备的天然游离态虾青素产品中游离虾青素的得率和纯度分别达到80％和60％以上，显著优于对比例1。表明本发明采用双酶解协同双异相富集的方法，实现了雨生红球藻油中游离态虾青素的高效制备，满足了产品的应用过程中的剂量需求。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。