1.一种人多能干细胞来源的脊髓olig2+神经祖细胞诱导及自我更新培养体系,其特征在于,包含基础培养基以及与该基础培养基分别组合使用的诱导分化因子和体外维持因子,
其中,所述诱导分化因子至少包括0.01-50μmgsk3抑制剂、0.01-500μmtgfβ抑制剂以及0.01-500μmbmp抑制剂;
所述体外维持因子包括0.01-50μmgsk3抑制剂、0.01-500μmtgfβ抑制剂、0.01-5000ng/mlsonichedgehog、0.01-20μmsmoothened激动剂、0.01-500ng/mlegf家族生长因子、0.01-500ng/mlfgf家族生长因子、0.01-500μmbmp抑制剂、0.01-50μmjak1/2抑制剂、0.01-10000nmsrc激酶抑制剂和0.01-50μmretinoicacid。
2.根据权利要求1所述的人多能干细胞来源的脊髓olig2+神经祖细胞诱导及自我更新培养体系,其特征在于:
其中,所述基础培养基包括dmem/f12液体基础培养基、0-5×b27添加剂、0-5×n2添加剂、1%青霉素/链霉素、0.01-500μg/ml2-磷酸-维生素c;
所述gsk3抑制剂包括chir99021、bio及ly2090314中的一种或多种;
tgfβ抑制剂包括sb431542、ly2109761及a-83-01中的一种或多种;
bmp抑制剂包括dmh1、k02288、ldn-193189、noggin中的一种或多种;
smoothened激动剂包括purmorphamine、sag及gsa10中的一种或多种;
egf家族生长因子包括egf、tgfα及hb-egf中的一种或多种;
fgf家族生长因子包含fgf1~fgf23中的任意一种或多种;
jak1/2抑制剂包括ruxolitinib、azd1480、pacritinib及filgotinib中的一种或多种;
src激酶抑制剂包括dasatinib、saracatinib及kx2-391中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的人多能干细胞来源的脊髓olig2+神经祖细胞诱导及自我更新培养体系,其特征在于:
其中,b27添加剂的量为0.5×b27添加剂,n2添加剂的量为0.5×n2添加剂,2-磷酸-维生素c的浓度为60μg/ml。
4.根据权利要求1所述的人多能干细胞来源的脊髓olig2+神经祖细胞诱导及自我更新培养体系,其特征在于:
其中,所述诱导分化因子中,gsk3抑制剂为3μm的chir99021,tgfβ抑制剂为2μm的sb431542,bmp抑制剂为2μm的k02288;
体外维持因子中,gsk3抑制剂为1μm的chir99021,tgfβ抑制剂为2μm的sb431542浓度,sonichedgehog的浓度为100ng/ml,smoothened激动剂为0.2μm的sag,egf家族生长因子为10ng/ml的egf,fgf家族生长因子为20ng/ml的fgf2,bmp抑制剂为1μm的k02288,jak1/2抑制剂为1μm的ruxolitinib,src激酶抑制剂为10nm的dasatinib,retinoicacid的浓度为0.5μm。
5.采用权利要求1~4任一项所述的培养体系于体外获得人多能干细胞来源的脊髓olig2+神经祖细胞并维持其自我更新的方法,其特征在于,包括如下步骤:
a、诱导人多能干细胞分化获得脊髓神经祖细胞
将人多能干细胞接种至基质胶包被的培养板上,当人多能干细胞的融合度达到30%左右时,弃去人多能干细胞扩增培养基,更换为由基础培养基和诱导分化因子组成的诱导培养基诱导多能干细胞分化,当细胞融合度达到70%-80%时进行传代并隔天换液,诱导分化一周后,稳定获得后端化的具有脊髓特征的神经祖细胞,
其中,所述人多能干细胞培养基的成分如下:基础培养基dmem/f12、0.5×n2、0.5×b27、60μg/ml抗坏血酸葡萄糖苷、1%青霉素/链霉素、40ng/ml碱性成纤维生长因子、2ng/ml转化生长因子-β;
b、诱导脊髓神经祖细胞腹侧化获得脊髓olig2+神经祖细胞
将脊髓神经祖细胞接种至含有1%基质胶的培养体系包被的培养板上,当细胞的融合度达50%左右时弃旧培养基,更换由基础培养基和体外维持因子组成的培养体系开始腹侧化诱导,当细胞融合度达到90%时,传代至新的以基质胶包被的培养板中并隔天换液,经过12~16天的腹侧化诱导,获得较高比例的脊髓olig2+神经祖细胞;继续利用该培养体系进行培养,每天进行半量换液,使细胞长期稳定扩增并维持其神经祖细胞的状态。
6.根据权利要求5所述的于体外获得人多能干细胞来源的脊髓olig2+神经祖细胞并维持其自我更新的方法,其特征在于:
其中,所述人多能干细胞为人胚胎内细胞团来源的胚胎干细胞细胞系或经体细胞重编程获得的诱导多能干细胞。
7.根据权利要求5中的方法获得的人脊髓olig2+神经祖细胞在中枢神经类疾病的治疗细胞以及神经组织再生或神经性疾病体外药物筛选中的应用。