DNA拉链分子修饰的脂质体囊泡及制备方法和应用

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种dna拉链分子修饰的脂质体囊泡及制备方法和应用。

背景技术：

外泌体由于包含生物体内重要的细胞间信息交流分子，可用于生物检测和诊断治疗等多个领域，因而受到越来越多的关注。外泌体最初是指网织红细胞分化过程中分泌的由多泡体与质膜融合所形成的40-100nm的囊泡状结构。外泌体的外层是磷脂双分子层，其中包含与来源细胞相关的蛋白质、mrna、mirna、dna片段等，这是外泌体参与细胞间信息与物质交流的重要基础。外泌体广泛地存在于血液、唾液、尿液、眼泪和脑脊液等中，并且具有较高丰度。尤其值得注意的是外泌体中包含的mirna，它们在细胞间的信息交流中扮演着十分重要的角色，成为调节受体细胞生物活性以及细胞表型变化的重要影响因素。例如，肿瘤来源的外泌体通常含有大量肿瘤相关的生物活性物质，如肿瘤相关mrna、mirna等，其所含的mirna含量与癌细胞十分相近。已有研究表明外泌体中的mirna积极地参与了肿瘤的生长，转移，肿瘤的免疫逃逸，以及肿瘤微环境的形成等过程，例如肿瘤分泌的mir-214通过外泌体传递到受体cd4⁺t细胞，导致cd4⁺t细胞中pten蛋白下调，调控性t细胞的扩增，最终导致了宿主的免疫逃逸以及肿瘤的快速增长。尽管肿瘤环境中外泌体所包含的mirna，其功能和相关的分子机制还有待进一步完善，但大量的研究已经证实外泌体内mirna可以作为一种重要的肿瘤标志物应用于癌症的早期诊断。

现有的临床肿瘤诊断主要分为：影像诊断、组织活检以及液体活检。其中，最为成熟的影像诊断和组织活检，因为其滞后性和侵入性很难应用于肿瘤的早期诊断以及获得较为全面的肿瘤相关信息。因此，后来发展的液体活检，一种非入侵性，有望获得较为全面信息，样本来源简单的方法被寄予了非常大的希望。液体活检又可以分为循环肿瘤细胞、循环肿瘤核酸以及外泌体检测三大类。据统计每毫升的血液当中只能检测到1-10个肿瘤细胞，这给肿瘤细胞的分离以及检测带来了很大的困难。而对于循环肿瘤核酸由于血液中核酸酶的存在使得其中能够检测到的含量也是很微小的，这也给检测的准确性带来负面影响。而外泌体在血液中具有较高丰度，每毫升可以检测到约10⁹个，并且由于其具有磷脂双分子膜的保护使得内部的核酸分子免于血液循环当中核酸酶的降解。因此，分析检测外泌体内的核酸分子，有利于疾病的诊断及疗效分析，具有极其重要的科研和临床意义。

现有的外泌体中核酸分子的检测主要依赖分离后破碎收集内部核酸的方式进行。常用的外泌体分离方法有差速离心法、密度梯度离心、尺寸排阻色谱等。这些方法解决了收集外泌体的问题，但是也有一定的局限性。差速离心利用不同转速对样本中的各个组分进行分离，但是由于血浆中各种囊泡和蛋白聚集体的存在使得最终得到的外泌体混有较多其他杂质，另外最终超高速离心的步骤容易导致外泌体的破坏；密度梯度离心是将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，但是仍然可以在提取产物中发现密度相似的杂质；尺寸排阻法是基于分子大小而非分子量实现分离的，但是这种方法过程冗长，不适合大量样本的处理。然而，要实现外泌体中具体核酸的检测，不仅需要外泌体的分离收集，后续还需要将外泌体破坏检测其中的核酸。核酸的暴露容易造成核酸酶降解，影响检测结果的准确性。

用于检测核酸分子的分子探针有分子信标、核酸荧光探针、基于纳米粒子的荧光耀斑探针等。以分子信标为例，其是一类具有特殊发夹结构的荧光探针，一端带有荧光基团，另外一端带有相应的淬灭基团。在检测分子与分子探针结合之后，被淬灭的荧光信号会被释放出来从而检测对应的核酸序列。此方法被广泛应用于基因筛查、生物传感器的开发和核苷酸检测等方面。发夹结构的热稳定性、内部信号转移的高效性，以及发卡结构序列的可设计性，赋予分子信标优异的灵敏度和选择性，可以在不分离未结合探针的情况下检测目标序列，为核酸的实时检测提供了可能。通过分子信标与外泌体共同孵育，分子信标被动扩散进入外泌体，可以实现对外泌体内肿瘤标志物mir-21的检测。但是单纯的分子信标跨膜效率低，可能无法保证检测的精准度。通过加入增加外泌体膜通透性的酶可以提高分子信标的扩散效率，但是同时会带来外泌体内生物标志物的泄露，给检测带来误差。同时，提取后的外泌体溶液中可能存在游离mirna，将发卡结构的分子信标与外泌体直接共培养可能导致对外泌体内实际mirna含量测定的干扰，裸露的分子信标可能被体液中的核酸降解，影响检测的准确性。基于上述分析，现有利用分子探针检测外泌体内核酸分子的技术中，存在以下问题(1)需要预先分离外泌体，分离步骤冗长，细胞外囊泡种类多样，分离产物中常包含其他类型的囊泡和蛋白质聚集体，分离步骤也会造成外泌体的破坏；(2)分子探针通过扩散进入外泌体的效率低，且在体液中容易被核酸酶分解，可能产生非特异信号，因此难以实现外泌体内核酸分子的精准、高效检测。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明的目的之一是提供一种双分子层膜并包载分子探针的dna拉链分子修饰的脂质体囊泡。

本发明的目的之二是提供一种dna拉链分子修饰的脂质体囊泡的制备方法。获得质量可控，大小均一的囊泡，同时实现dna片段的脂类基团修饰，并将修饰后的dna片段互补配对以后引入到囊泡的表面。

本发明的目的之三是提供一种dna拉链分子修饰的脂质体囊泡的用途，可以用于分析检测外泌体内核酸分子，并对体液样本中的疾病相关外泌体进行分选。检测结果可以用于疾病的早期诊断、疗效评估和预后分析。具体地，该囊泡可与dna拉链修饰后的外泌体，在dna拉链的辅助下进行快速膜融合。从而将囊泡内部的分子探针递送到外泌体内，实现外泌体内核酸分子的原位、准确、快速检测。该囊泡可实现对其中包裹的分子探针进行保护，防止其被体液中的酶降解；另外可以避免外泌体的分离及破碎过程。

为达到上述之一目的，本发明的解决方案是：

一种dna拉链分子修饰的脂质体囊泡由双分子层膜和双分子层膜内部包裹的分子探针构成，其中双分子层膜的表面修饰有能够促进膜融合的dna拉链分子。

dna拉链分子由已修饰亲脂性基团的短链dna和长链dna组成，其中短链dna和长链dna中靠近亲脂性基团的一段序列完全互补组装形成dna拉链分子。

亲脂性基团选自胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱中的一种以上。

根据本发明的一种实施方式，dna拉链分子在修饰亲脂性基团之前，需要进行预先处理，其方法选自如下之一：

a、利用带有巯基修饰的dna拉链分子与带有马来酰亚胺的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

b、利用带有马来酰亚胺修饰的dna拉链分子与带有巯基的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

c、利用带有叠氮修饰的dna拉链分子与带有炔基的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

d、利用带有炔基修饰的dna拉链分子与带有叠氮的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

e、利用带有氨基修饰的dna拉链分子与带有羧酸的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

f、利用dna固相合成反应将带有脂类基团的亚磷酰胺单体接到dna拉链分子的一端，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

优选地，双分子层膜选自天然生物膜合成的双分子层膜、两亲性分子合成的双分子层膜中的一种以上。

更优选地，天然生物膜选自细胞膜、细菌膜和病毒膜中的一种以上。

优选地，两亲性分子选自二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱中的一种以上。

优选地，分子探针选自核酸分子信标、核酸荧光探针和纳米耀斑探针中的一种以上。即双分子层膜的内部可同时包裹一种或多种分子探针。

为达到上述之二目的，本发明的解决方案是：

一种如上述的dna拉链分子修饰的脂质体囊泡的制备方法，选自如下之一：

a、双分子层膜是天然生物膜时，首先粉碎双分子层膜与分子探针混合，通过挤压得到囊泡，然后与一端带有亲脂性基团修饰的dna拉链分子(dna片段)孵育，得到dna拉链分子修饰的脂质体囊泡；或者，

b、双分子层膜是两亲性分子合成的双分子层膜时，将双分子层膜直接与分子探针混合，通过挤压得到囊泡，然后与一端带有亲脂性基团修饰的dna拉链分子(dna片段)孵育，得到dna拉链分子修饰的脂质体囊泡；或者，

常规薄膜水化法：将两亲性分子溶解在有机溶剂中，旋蒸得到固体薄膜，加水超声后通过脂质体挤出器挤压，并通过特定孔径的聚碳酸酯膜得到特定大小的脂质体囊泡。

优选地，天然生物膜选自细胞膜、细菌膜和病毒膜中的一种以上。

优选地，两亲性分子选自二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱中的一种以上。

优选地，亲脂性基团选自胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱中的一种以上。

优选地，为得到带有亲脂性基团修饰的dna片段，需要将dna片段预先处理，其方法选自如下之一：

a、利用带有巯基修饰的dna片段与带有马来酰亚胺的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

b、利用带有马来酰亚胺修饰的dna片段与带有巯基的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

c、利用带有叠氮修饰的dna片段与带有炔基的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

d、利用带有炔基修饰的dna片段与带有叠氮的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

e、利用带有氨基修饰的dna片段与带有羧酸的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

f、利用dna固相合成反应将带有脂类基团的亚磷酰胺单体接到dna片段的一端，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

优选地，dna拉链分子修饰的脂质体囊泡的粒径为50nm-1.5μm。

为达到上述之三目的，本发明的解决方案是：

一种如上述的dna拉链分子修饰的脂质体囊泡在检测外泌体内的核酸分子标志物中的应用，利用囊泡可高效快速检测目标外泌体内的核酸生物标志物。

优选地，核酸分子选自mrna、mirna、lncrna、circrna和dna中的一种以上。

检测目标外泌体需要与囊泡表面dna序列相互补配对的序列进行孵育，使其能够与囊泡顺利融合。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

第一、本发明的dna拉链分子修饰的脂质体囊泡由双分子层膜和双分子层膜内部包裹的分子探针构成，其中双分子层膜的表面插入有dna序列，这段dna序列与插入到外泌体表面的dna序列发生碱基互补配对的“dna开拉链反应”，从而尽可能地拉近外泌体与包载有分子探针的脂质体囊泡之间的距离，使得二者发生膜融合过程，将脂质体囊泡内部的分子探针递送到外泌体内，进而检测外泌体内的核酸生物标志物，实现外泌体内核酸分子的原位、准确、快速检测。可避免预先分离外泌体，并且避免分子探针裸露在体液中被体液中的核酸酶降解，检测速度更快，耗时更短，检测结果更准确。本发明提供的利用外泌体以及脂质体囊泡表面修饰的dna拉链分子进行膜融合检测的过程属于主动融合，融合效率更高，检测效果更好。

第二、本发明的脂质体囊泡中包载的分子探针可根据具体待检测的靶标核酸序列进行设计，因此可实现多种疾病特异核酸分子的检测，从而获取相应的诊断信息。

第三、本发明采用dna插入脂类膜促进膜融合的策略简单易行，只需要在常温孵育即可完成效率接近100％的脂质体囊泡表面修饰，故具有大规模生产应用的潜力。

附图说明

图1为本发明的脂质体囊泡与外泌体的融合过程示意图。

图2为本发明的实施例中脂质体囊泡的透射电镜图。

图3为本发明的实施例中脂质体囊泡的粒径和浓度示意图。

图4为本发明的实施例中脂质体囊泡的琼脂糖凝胶电泳图。

图5为本发明的实施例中脂质体囊泡在pbs和50％胎牛血清中粒径变化图。

图6为本发明的实施例中外泌体的透射电镜图。

图7为本发明的实施例中外泌体的粒径和浓度图。

图8为本发明的实施例中脂质体囊泡与外泌体融合实验中外泌体表面标志物cd63、cd9、cd81的表达图。

图9为本发明的实施例中脂质体囊泡与外泌体融合检测实验中的荧光强度-时间图。

图10为本发明的实施例中脂质体囊泡与正常人血清融合产物的流式分析散点图。

图11为本发明的实施例中脂质体囊泡与肿瘤病人血清融合产物的流式分析散点图。

图12为本发明的实施例中脂质体囊泡与正常人血清融合产物的流式分析直方图。

图13为本发明的实施例中脂质体囊泡与肿瘤病人血清融合产物的流式分析直方图。

具体实施方式

本发明提供了一种dna拉链分子修饰的脂质体囊泡及制备方法和应用。

生物膜融合受到snare蛋白(可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体)的严格调控；位于运输囊泡和靶细胞膜的蛋白质之间的分子识别导致snare蛋白复合物的形成，该复合物催化必需的脂质重排合并相邻的脂质双层。受此启发，本发明采用了一种通过膜锚定dna链杂交(即dna拉链分子)来实现融合脂质囊泡的方法，通过脂质体囊泡膜与外泌体膜融合的方法高效递送分子探针，进而检测外泌体内核酸分子。这种检测手段不需要酸性环境、改变膜通透性的酶或离子、复杂生物合成过程的膜融合蛋白，具有简单高效，大规模生产应用的潜力。

<dna拉链分子修饰的脂质体囊泡>

本发明的dna拉链分子修饰的脂质体囊泡由双分子层膜和双分子层膜内部包裹的分子探针构成，其中双分子层膜的表面修饰具有能够促进膜融合过程的dna拉链分子。

如图1所示，该dna拉链分子(dna片段)与外泌体膜表面修饰的dna序列发生碱基互补配对，使得脂质体囊泡与外泌体高效融合，从而将囊泡内部的分子探针递送到外泌体内，进而检测外泌体内的核酸分子，进一步实现外泌体内核酸分子的原位、准确、快速检测。插入到外泌体膜以及脂质体膜中的dna需要预先在dna的一端修饰上亲脂性基团，如采用双链dna拉链的模式则需要退火处理得到双链dna，再利用其亲脂性基团与膜之间优异的相容性修饰到外泌体与脂质体膜表面。这种外泌体检测手段可避免预先分离外泌体，并且避免分子探针裸露在体液中被体液中的核酸酶降解，检测速度更快，耗时更短，检测结果更准确。本发明提供的脂质体囊泡表面具有的dna序列可与dna修饰的外泌体主动融合，融合效率更高，检测效果更好。

其中，dna拉链分子的一端可以由多种脂质基团修饰，从而可插入到膜中，即与组成细胞膜的脂类具有良好相容性的脂类基团。dna拉链分子由已修饰亲脂性基团的短链dna和长链dna组成，具体地，短链dna的序列可以设计为：3’-x-a’-5’，长链dna的序列可以设计为：5’-x-a-b-3’，其中短链dna中a’部分与长链dna中a部分为互补序列；用于外泌体检测时，嵌入外泌体上的dna拉链分子为长链序列设计为：3’-x-a’-b’-5’,短链序列设计为：5’-x-a-3’；上述序列设计中a与a’为互补序列，b与b’为互补序列。其中，短链dna的序列包括但不限于为：5’-aggcagcacgga-x-3’，长链dna的序列包括但不限于为：5’-x-tccgtcgtgccttatttctgatgtcca-3’，x为亲脂性基团，修饰的亲脂性基团包括但不限于胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱等脂类。dna拉链分子只要满足拉链目的，即囊泡上的dna拉链序列能与外泌体上的拉链进行互补配对即可，在此不作具体限定。

另外，dna拉链分子在修饰亲脂性基团之前，需要进行预先处理，其方法选自如下之一：

a、利用带有巯基修饰的dna拉链分子与带有马来酰亚胺的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

b、利用带有马来酰亚胺修饰的dna拉链分子与带有巯基的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

c、利用带有叠氮修饰的dna拉链分子与带有炔基的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

d、利用带有炔基修饰的dna拉链分子与带有叠氮的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

e、利用带有氨基修饰的dna拉链分子与带有羧酸的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

f、利用dna固相合成反应将带有脂类基团的亚磷酰胺单体接到dna拉链分子的一端，得到带有脂类基团修饰的dna拉链分子。

双分子层膜选自天然生物膜合成的双分子层膜、两亲性分子合成的双分子层膜中的一种以上。实际上，天然生物膜包括但不限于细胞膜、细菌膜和病毒膜等。两亲性分子包括但不限于二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱等。

分子探针包括但不限于核酸分子信标、核酸荧光探针和纳米耀斑探针等。双分子层膜的内部可同时包裹一种或多种分子探针，可实现多种疾病特异核酸分子的同时检测，获取更丰富的诊断信息。

<dna拉链分子修饰的脂质体囊泡的制备方法>

本发明的dna拉链分子修饰的脂质体囊泡的制备方法，选自如下之一：

a、双分子层膜是天然生物膜时，首先利用细胞培养获得大量生物膜，研磨破碎细胞，离心获得膜碎片，将膜碎片与分子探针混合后，通过挤压得到囊泡，然后采用物理结合的方法在囊泡表面与一端带有亲脂性基团修饰的dna片段孵育，得到dna拉链分子修饰的脂质体囊泡；或者，

b、双分子层膜是两亲性分子合成的双分子层膜时，将双分子层膜直接与分子探针混合，通过挤压得到囊泡，然后采用物理结合的方法在囊泡表面与一端带有亲脂性基团修饰的dna片段孵育，得到dna拉链分子修饰的脂质体囊泡；或者，

常规薄膜水化法：将两亲性分子溶解在有机溶剂中，旋蒸得到固体薄膜，加水超声后通过脂质体挤出器挤压，并通过特定孔径的聚碳酸酯膜得到特定大小的脂质体囊泡。

其中，天然生物膜包括但不限于细胞膜、细菌膜和病毒膜等。

两亲性分子包括但不限于二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱等。

亲脂性基团包括但不限于胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱等。

为得到带有亲脂性基团修饰的dna片段，需要将dna片段预先处理，其方法选自如下之一：

a、利用带有巯基修饰的dna片段与带有马来酰亚胺的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

b、利用带有马来酰亚胺修饰的dna片段与带有巯基的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

c、利用带有叠氮修饰的dna片段与带有炔基的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

d、利用带有炔基修饰的dna片段与带有叠氮的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

e、利用带有氨基修饰的dna片段与带有羧酸的脂类进行反应，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

f、利用dna固相合成反应将带有脂类基团的亚磷酰胺单体接到dna片段的一端，得到带有脂类基团修饰的dna片段。

具体地，挤压得到脂质体囊泡时可采用聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔径为50nm-1.5μm，因此该囊泡的粒径为50nm-1.5μm，由此可实现囊泡的大小均一，质量可控。

<dna拉链分子修饰的脂质体囊泡的用途>

本发明的dna拉链分子修饰的脂质体囊泡可以在检测外泌体内的核酸分子标志物中应用，检测结果可以用于疾病的早期诊断、疗效评估和预后分析。

其中，核酸分子为mrna、mirna、lncrna、circrna和dna中的任意一种。

以下结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。

实施例：

具体描述利用两亲性分子制备脂质体囊泡以及性能表征。

1、制备包载分子探针的脂质体囊泡

将选取的与外泌体膜有良好相容性的人工脂质溶解到适量的氯仿当中，形成均一透明的溶液体系，旋蒸得到多组分混合均一的脂质膜固体片。之后将其放入冷冻干燥机中过夜进一步除去其中的溶剂。在ph＝7.5的缓冲溶液(10mmtris/hcl，150mmnacl，1mmedta)中将脂质片与分子探针混合后，超声使得体系乳化，采用脂质体挤出器依次通过800nm、400nm、200nm的聚碳酸脂膜，每个不同孔径聚碳酸脂膜往复挤出，即得包载有分子探针的脂质体囊泡。

2、固相合成脂质分子修饰的dna

亲脂性亚磷酰胺类化合物在寡聚核苷酸的5’端结合组成最终的“碱基”，利用注射器合成技术将亲脂性亚磷酰胺溶解于二氯甲烷中并与低聚物偶联。简单地说，将亲脂磷酰胺(200μl)与活化剂(200μl乙腈，0.2mm5-乙基硫代四唑)混合，用两支注射器将混合物前后推过cpg柱10次。或者，亲脂性亚磷酰胺也可以使用dna合成器耦合(15min耦合时间)。合成后，用c4柱(biobasic-4，200mm×4.6mm，thermo-scientific)、100mm三乙胺-乙酸缓冲液(teaa，ph＝7.5)-乙腈(0-30min，10-100％)作为洗脱剂，从cpg中切割dna并通过反相高效液相色谱法进行脱保护和纯化。

3、制备表面修饰dna拉链分子的脂质体囊泡，dna拉链分子由两条长短不一的dna单链配对后组成，本实例的具体序列为：5’-x-tccgtcgtgccttatttctgatgtcca-3’,5’-aggcagcacgga-x-3’，x为二油酰磷脂酰胆碱(亲脂性基团)，但dna拉链的序列不仅限于该序列。

将带有亲脂性基团修饰的dna片段与制备好的脂质体囊泡按照摩尔比100：1混合后在37℃孵育30min，即得到表面由dna拉链分子修饰的脂质体囊泡。

4、脂质体囊泡的表征

将脂质体囊泡滴在封口膜上，铜网漂浮在液滴上吸附20min，2％的磷钨酸染色1min，采用透射电镜检测该脂质体的大小及形态。结果如图2所示，脂质体囊泡分散均匀，为茶托型或一侧凹陷的半球形。

采用马尔文纳米颗粒跟踪分析仪可以测定脂质体囊泡的浓度，结果如图3所示，脂质体囊泡的浓度约为1.62×10¹⁰个/ml，粒径大小约为100nm。

为了考察dna插入到脂质体囊泡中的情况，分别采用不同荧光染料标记dna和脂质体囊泡，如图4所示，dna插入后，游离dna条带消失，效率接近100％，琼脂糖凝胶电泳显示两种荧光信号重合良好，并且原本弥散的dna链滞留在上样孔内，表明dna修饰在了脂质体囊泡上。

为了考察该种脂质体囊泡在模拟生理环境，即0.01mpbs以及50％胎牛血清中的稳定性。采用动态光散射仪监测该种脂质体囊泡在两种液体环境下72h内的粒径变化，如图5所示，在72h内该脂质体囊泡未见明显粒径变化，表明该脂质体囊泡在模拟生理环境下具有良好的稳定性。

5、dna拉链分子修饰并包载核酸分子信标的脂质体囊泡与外泌体融合实验

如若使用脂质体囊泡检测外泌体内的核酸分子，是不需要提前提取外泌体的，但在实验室条件有限，先提取出外泌体，然后再模拟人体内的外泌体环境。以此来证明脂质体囊泡与外泌体的融合。

5.1、外泌体的提取分离与鉴定

采用人乳腺癌mcf-7细胞外泌体和人正常乳腺mcf-10a细胞作为研究对象。培养皿中的mcf-7或mcf-10a细胞生长至70％时，pbs清洗2次，用去除外泌体的培养基培养48h后，收集上清液，在4℃，2000×g离心10min，去除培养液中的细胞及细胞碎片。上清液20000×g离心30min，进一步去除培养液中的大粒径囊泡。上清液110000×g离心70min，除去上清液，用pbs重悬底部沉淀，110000×g离心70min。弃上清液，pbs重悬沉淀即得肿瘤或正常细胞外泌体。通过纳米颗粒跟踪分析仪测定外泌体浓度，配置外泌体标准溶液。

采用透射电镜检测外泌体的大小及形态。结果如图6所示，外泌体为茶托型或一侧凹陷的半球形，粒径大小为30-150nm。

采用马尔文纳米颗粒跟踪分析仪可以测定外泌体的浓度，结果如图7所示，脂质体囊泡的浓度约为1.66×10¹¹个/ml。

采用免疫印迹法考察外泌体表面cd63、cd9、cd81等标志物的表达。结果如图8所示，在外泌体以及产生外泌体的mcf-7细胞膜中可以发现明显的cd63、cd9、cd81等标志物的条带，说明所得囊泡确实为外泌体。

5.2、dna拉链分子修饰并包载核酸分子信标的脂质体囊泡原位检测外泌体内目标核酸分子

采用mir-21为检测目标，脂质体囊泡内包载可检测mir-21的分子探针。dna拉链分子修饰并包载核酸分子信标的脂质体囊泡分别与正常细胞提取外泌体和肿瘤细胞提取外泌体按适当比例室温共同孵育，融合产物通过稳态瞬态荧光光谱仪(fls1000)测定荧光强度。结果如图9所示，肿瘤外泌体的融合产物的荧光强度明显高于正常外泌体组，定量结果显示肿瘤外泌体的融合产物的荧光强度增加了约40％；正常外泌体融合产物的荧光强度基本没有变化；裸露的分子信标通过被动扩散进行检测的荧光强度只增加了10％。上述结果可以解释为肿瘤外泌体内mir-21含量显著高于正常外泌体，并且通过被动扩散进行外泌体检测的效果要显著优于单纯的分子信标检测。

6、dna拉链分子修饰并包载核酸分子信标的脂质体囊泡检测肿瘤外泌体内的核酸分子

为进一步考察脂质体囊泡原位检测临床样本外泌体内核酸分子的效果，我们收集了乳腺癌病人和正常人的血液样品。经过初步的超滤和过滤除去多余的蛋白和大的胞外囊泡后，加入带有脂类基团的dna片段孵育，然后将由dna拉链分子修饰的并包载核酸分子信标的脂质体囊泡加入到病人和志愿者的血浆中，共同孵育一定时间后，通过流式细胞仪测定荧光强度。结果如图10至图13所示，正常组仅有一个群落存在于荧光较弱的区域，显示其为正常来源外泌体，而肿瘤患者组，在荧光较弱的区域和荧光较强的区域各存在一个群落，表明其分别为正常来源的外泌体和肿瘤来源的外泌体。上述结果说明，该脂质体囊泡有望通过检测外泌体内核酸分子来诊断肿瘤病人。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。