一种单细胞测序筛选软骨细胞标记分子的方法

本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种利用单细胞测序筛选软骨细胞标记分子的方法。

背景技术：

骨关节炎是以关节软骨退化、软骨下骨硬化，骨赘形成并伴有关节疼痛、肿胀、畸形及活动障碍的慢性退行性关节病，且多发于膝、髓等负重关节叫。据统计全世界骨关节炎患病率约为15％，其中50岁以上老年人群的发病率达到50％，最终致残率高达53％。我国流行病调查研究发现我国40岁以上人群膝、手、颈、腰关节炎的总患病率则高达46.3％。关节功能的丧失及致残不仅严重影响老年人群的生活质量还加重家庭和社会的经济负担，有效预防该病已成为国内外重大的公共卫生问题。

骨关节炎发病与衰老软骨细胞的累积导致的软骨细胞外基质合成降解平衡失调，关节软骨组织的分解退变，关节内持续病理性炎症状态密切相关。临床骨关节炎患者的关节软骨细胞常会出现衰老现象，且该现象随着关节软骨组织退变的严重程度越发明显。软骨细胞衰老在骨关节炎的发生发展过程中起着重要作用，因此延缓或清除衰老软骨细胞有可能抑制骨关节炎的炎性反应，保护关节软骨组织的完整性，改善骨关节炎的病理变化，缓解骨关节炎患者的疼痛。

因此，若能不断发现软骨细胞的特异性标记分子及调控因子，从分子水平探讨骨关节炎与软骨细胞之间的相互作用，可为深刻揭示骨关节炎发病的机制提供更有效的科学依据，同时也能为临床治疗骨关节炎提供新思路和新方法。

我们利用单细胞测序技术在软骨细胞的单细胞水平上对全转录组进行扩增与测序，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控的规律，最后利用生物信息学分析技术，从mrna水平上分析寻找软骨细胞的特异性标记分子，为骨关节炎的靶向治疗提供新靶点。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述存在的科学问题，提供一种单细胞测序筛选软骨细胞标记分子的方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明的单细胞测序筛选软骨细胞标记分子的方法，包括以下步骤：

1)提取软骨组织；

2)分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液；

3)对样品的mrna进行逆转录得到cdna：使用美国thermofisher公司的superscript试剂盒构建逆转录体系，对上述步骤2)获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cdna；

4)以cdna为模板进行pcr扩增，构建测序文库，进行测序：使用美国illumina公司的nexteraxt试剂盒，按照说明书对上述步骤3)得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序；

5)对测序结果进行生物信息学分析，从mrna水平上分析寻找软骨细胞的特异性标记分子。

以上所述步骤1)中，将从软骨组织中提取的细胞进行单细胞测序，利用生物信息学分析从mrna水平上寻找其特异的标记分子。

本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

通过利用单细胞测序技术，将从软骨组织中提取的软骨细胞进行单细胞测序，利用生物信息学分析从mrna水平上寻找其特异的标记分子，为靶向治疗寻找新的靶点提供更为全面、客观、准确的方法。

附图说明

图1为单细胞测序检测软骨组织中细胞亚群。

图2为气泡图展示软骨组织中软骨细胞的标记分子表达情况。

图3为聚类热图示软骨组织中软骨细胞的标记分子表达情况。

具体实施方式

下面对本发明的实施操作做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

1.应用自创的提取方法获得高质量的软骨组织细胞。

2.准备软骨组织单细胞样品。分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解。

3.对样品的mrna进行逆转录得到cdna：使用美国thermofisher公司的superscript试剂盒构建逆转录体系，对步骤3)获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cdna。

4.以cdna为模板进行扩增，构建测序文库，进行测序，使用美国illumina公司的nexteraxt试剂盒，按照说明书对步骤4)得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序。

5.通过生物信息学分析寻找软骨细胞特异性的标记分子。

实施例1

本实施例选择临床手术中骨关节炎患者的膝骨关节软骨为实验材料，对其软骨细胞进行了单细胞转录组的测序。

1.获取软骨组织中的软骨细胞：

1)软骨细胞的提取方法：

s1)用眼科剪剪碎软骨组织得到单细胞；

s2)分选所述单细胞得到所述软骨细胞。

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

2)单细胞的制备

在手术台内，用无菌剪刀和无菌镊子从消毒后的患者膝骨关节，小心剥离得到软骨组织。用眼科剪稍微剪碎软骨组织并在0.01mpbs中浸泡2min后将其取出，用pbs冲洗，冲洗3次,得到浸泡后的软骨组织。用眼科剪在无菌平皿上充分剪碎浸泡后的软骨组织，在剪碎浸泡后的软骨组织的过程中适时滴加0.01mpbs，保持该软骨组织处于湿润状态，得到剪碎的软骨组织。向上述盛有剪碎的软骨组织的无菌平皿中胶原酶ⅰ溶液，用剪过头的1ml枪头吹散软骨组织，得到胶原酶ⅰ和软骨组织混合物。

(1)涡旋：将盛有胶原酶ⅰ和软骨组织混合物的50ml离心管在震荡器上进行震荡3min，得到震荡后的胶原酶和软骨组织混合物放培养箱中消化30min，每5min拿出涡旋一次

(2)用完全培养基终止胶原酶，静置2min,离心300g(rcf),10min,pbs洗2次。

(3)将得到的细胞放冰上孵育抗体：10⁷cell+100μlbuffer+10μl抗体，避光，摇匀，放2-8℃冰箱，孵10min。

(4)10⁷cell+2mlbuffer洗涤,300g(rcf)10min。

(5)离心后每10⁷cell加80μlbuffer，每10⁷cell加20μl磁珠混匀，在2-8℃冰箱孵育15min.

(6)每10⁷细胞加2mlbuffer，300g(rcf)10min洗后加500μlbuffer混匀。ls型柱子用3mlbuffer润柱子，将细胞悬液加到柱子里过柱,滴完再分别洗3遍(ls柱子每次3ml)。

(7)收集细胞:拿下架子上ls柱加5mlbuffer快速打出。

将上述软骨细胞进行培养，培养条件为：dmem+10％fbs+1％双抗。得到贴壁的软骨细胞。

2.分离单细胞并进行裂解：

1)以rnasezap和无dna的溶液清理工作台及移液枪头；

2)混合以下试剂作为裂解缓冲液：

a)0.2％triton-x100溶液19μl；

b)40u/μl的rnase抑制剂1μl。

3)向0.2ml的薄壁pcr管中加入1.19μl裂解缓冲液；

4)以最小体积从步骤(2)所得的细胞中分离单细胞，体积一般为0.3μl，加入含裂解缓冲液的pcr管中。

4.对样品的mrna进行逆转录得到cdna：

1)混合以下试剂作为引物-dntp预混液：

a)dntp(10mm)10μl；

b)oligo-dt30vn引物(10μm)10μl。

2)混合以下试剂作为逆转录预混液：

a)美国thermofisher公司的superscriptiiifirst-strand缓冲液2μl；

b)美国thermofisher公司的superscriptiiireversetranscriptase溶液0.5μl；

c)rnase抑制剂(40u/μl)0.25μl；

d)dtt溶液(100mm)0.5μl；

e)甜菜碱溶液(5m)2μl；

f)氯化镁溶液(1m)0.06μl；

g)tso溶液(100μm)0.2μl；

h)ercc外源rna标准样溶液0.5μl。

3)在步骤(3)所得的含有细胞和裂解缓冲液的pcr管中加入2μl引物-dntp预混液；

4)快速涡旋震荡pcr管使溶液充分混合，在室温下以700g离心10s后立即置于冰上；

5)以72℃孵育样品3min，立即放回冰上；

6)在室温下以700g离心10s，收集pcr管底部的液体，将其置于冰上；

7)将逆转录预混液加入单细胞裂解产物中，使用移液器轻轻吹吸几次混匀样品，混匀过程中避免产生气泡；

8)在室温下以700g离心10s，收集pcr管底部的液体；

9)将含样品的pcr管置于pcr仪中，设定程序进行细胞mrna的逆转录，得到cdna第一链反应产物。

4.以cdna为模板进行扩增，构建测序文库，进行测序：

1)混合以下溶液作为pcr混合液：

a)步骤(4)中得到的第一链反应产物10μl；

b)美国rochemolecularsystems公司的kapahifihotstartreadymix溶液12.5μl；

c)ispcr引物溶液(10μm)0.25μl；

d)无核酸酶水2.25μl。

2)取15μl步骤1)中的pcr混合液加入pcr管中，涡旋震荡使样品混合，在室温下以700g离心10s，收集pcr管底部的液体；

3)将含样品的pcr管置于pcr仪中，设定程序进行细胞cdna的扩增。

4)在室温下将美国beckmancoulter公司的ampurexp磁珠放置15min，涡旋震荡混匀；

5)将25μl磁珠加入等体积步骤3)所得到的cdna扩增产物中，用移液器吹吸10次混匀，将溶液转移到96孔板中，在室温下孵育8min；

6)将96孔板在磁力架上放置5min，待溶液澄清，小心移除上清液；加入200μl的80％乙醇清洗磁珠，孵育30s后将小心移除乙醇，重复2次；

7)完全移除乙醇后，在室温下放置5min，待磁珠表面出现一道裂缝后，加入15μl的eb溶液，用移液器吹吸10次混匀；

8)移除磁力架，室温放置2min；将96孔板再放回磁力架上，放置2分钟，待溶液澄清后，吸取13μl的上清液，移到一个新的0.2ml薄壁pcr管中；

9)使用6％的page凝胶检测cdna扩增产物的片段大小分布，好的文库应该片段大小应该在500～3000bp之间，没有小于500bp的短片段，而且峰应该出现在1500～2000bp之间；

10)混合以下溶液作为标记预混液：

a)美国illumina公司的标记dna缓冲液4μl；

b)美国illumina公司的标记酶混合液1.67μl；

c)美国illumina公司的重悬缓冲液1.33μl。

11)取1μl步骤8)中得到的cdna，加入7μl步骤10)中的标记预混液，在55℃孵育10min，对cdna进行标记；

12)再加入2μl的美国illumina公司的nt缓冲液，在室温下孵育5min，完成标记反应；

13)混合以下溶液作为接头连接扩增预混液：

a)美国rochemolecularsystems公司的kapahifihotstartreadymix溶液15μl；

b)美国illumina公司的index1引物溶液2.5μl；

c)美国illumina公司的index2引物溶液2.5μl。

14)向步骤12)中得到的10μl标记产物中加入20μl步骤13)中的接头连接预混液，置于pcr仪中，设定程序进行接头的连接。

15)在室温下将美国beckmancoulter公司的ampurexp磁珠放置15min，涡旋震荡混匀；

16)将24μl磁珠按照0.8：1的体积比加入步骤13)得到的30μl产物中，用移液器吹吸10次混匀，将溶液转移到96孔板中，在室温下孵育8min；

17)重复步骤6)至步骤8)，纯化扩增产物；

18)使用6％的page凝胶和美国agilent公司的2100bioanalyzer检测步骤17)中获得测序文库的片段大小分布，并用美国thermofisher公司的qubit3.0荧光计测量各文库dna的浓度；

19)根据步骤18)中测得各文库的浓度及所需测序的数据量，计算最终文库混合液中各文库的摩尔比例，按比例将文库混合，使用qubit3.0荧光计测量，调整终浓度达到5nm；

20)送测序公司进行高通量测序。

选择骨关节炎患者软骨组织为实验材料仅是为了举例，证明此方法可以成功应用于人关节软骨组织的单细胞转录组测序，但本发明同样可以应用于人类及其他相关软骨细胞的单细胞转录组测序。

本发明并不局限于前述的具体实施方式，本发明扩展到任何本说明书中披露的新特征或新的组合，以及披露的任一新方法或过程的步骤或新的组合。