专利名称：分子印章测序装置和测序方法
技术领域：
本发明涉及一种基于焦磷酸测序原理的分子印章测序装置和测序方法，尤其涉及一种低成本、高通量的微阵列分子印章测序装置和测序方法。
背景技术：
人类基因组计划的完成，很大程度上归因于测序技术的发展和测序成本的降低。DNA测序成本已由十多年前的每个碱基约十美元降至现在每个碱基约十美分。但是，随着对人类基因组研究的深入，人们越来越清楚地认识到人们要真正要研究基因的功能，破解基因组这一自然进化产生的分子程序，进而在基因水平上进行临床诊断、疾病预防和易感性评估，只有对于大量的个人全基因组信息进行检测，通过比较不同表型人类的基因组差异，读懂这一分子程序语言。也就是说，借助大量个人全基因组信息的检测来认识不同人种、人群和个体之间DNA序列的差异，进而准确推断这些差异对疾病发生、发展规律的影响。这就需要进一步大幅度降低人类全基因组测序的成本。有专家提出了1000美元全基因组测序的目标，也就是说，DNA测序的成本将要进一步下降100万倍。因此，这对于人类是一个巨大的挑战，人类急需发展一种全新的超低成本的高通量DNA测序技术以来迎接个人医学和药学时代的挑战。
目前，比较普遍使用的测序方法是1977年Sanger发明的双脱氧测序法，虽然该方法已经过29年的发展与改进，在读取DNA序列长度方面已有极大的提高，但是它仍然具有通量低、速度慢和需要电泳或进行标记检测等弱点。而早期的Maxam和Gilbert化学裂解测序法，虽然也有较强测序能力，但由于该测序过程中要使用有毒的化学物质，而没有得到实际应用。杂交测序法由于其严重的非特异性杂交信号而影响测序的准确性，也很少被应用。此外，还有多种其它测序方法，大多只是在实验室研究阶段，离应用尚待时日。
焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术，该方法是在同一反应体系中四种酶(即DNA聚合酶、硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶)的级联催化作用下，待测ssDNA上结合的引物每发生一个碱基延伸，则会有一定强度的荧光信号被释放。这样在每一轮测序反应中，依次加入四种dNTP(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP)之一，通过检测每次荧光释放的有无和强度，就能够达到实时测定DNA序列的目的。该技术对DNA的序列分析无须电泳，DNA片段也无须标记，因此，具有自动化高，重复性好等优点。焦磷酸测序技术已经在单核苷酸多态性的研究、病因学分析、病原微生物的快速鉴定、法医鉴定等方面得到广泛的应用。目前，国内外运用该技术进行测序主要有两种方法。一种是普遍采用单管反应的焦磷酸测序方法，即每次进行一个样品的序列测定，这种情况下无疑使高通量检测受到限制。另一种是国外基于96孔板的并行焦磷酸测序方法，它是将96个不同的样本分别置于96个孔中，然后对这些样品进行测序，虽然这种方法的分析通量有所提高，但样品的制备比较麻烦且消耗药品较大。以上两种焦磷酸测序装置虽能实现对目的DNA序列的测定，但由于它们的反应体系均庞大且样品制备较麻烦，导致测序成本的极大提高。更为重要的是，由于焦磷酸测序反应体系为液相体系，每个测序反应均需要一个独立的反应腔，这就大大地限制了DNA测序的通量。为此，我们基于焦磷酸测序原理，提出了应用分子印章方法，发展了一种成本低、试剂消耗小且样品制备简单的高通量DNA测序方法，该方法将极大地降低DNA测序的成本，能够用于人类个体基因组的检测。
发明内容
技术问题本发明提供一种新型分子印章测序装置和测序方法，它可以在生物芯片上对DNA目的片段进行低成本、高通量、高灵敏度的分析。
技术方案本发明的生物芯片测序装置由DNA延伸基底、化学发光透明基片和机械连接臂三部分构成；其中，DNA延伸基底、化学发光透明基片分别固定在机械连接臂上；DNA延伸基底为一固体材料基底，在DNA延伸基底上与化学发光透明基片相对的一面为放置DNA及聚合酶的DNA延伸基底面，在化学发光透明基片上与DNA延伸基底相对的一面为放置发光相关酶和发光辅助物的发光透明基片面，在化学发光透明基片的另一面的外部设有发光检测器，发光检测器的输出端接信号分析装置。
DNA延伸基底的材料为玻璃、石英、金属、塑料、陶瓷、橡胶、凝胶、纸材、尼龙之一，或由它们中的二种或多种组成的复合物，且DNA延伸基底与化学发光透明基片相对的一面为一水平面；在DNA延伸基底上不与化学发光透明基片相对的一面，放置温度调控装置，如加热电极、半导体温控器件、光学加热、气流控温。放置发光相关酶和发光辅助物的基片面的材料为玻片、橡胶、石英、凝胶等材料之一，或由它们中的二种或多种组成的复合物。发光检测器为光电耦合器件CCD、光电倍增管PMT和互补性氧化金属半导体CMOS中的一种。机械连接臂上有两个卡，它们分别用来固定DNA延伸基底、化学发光透明基片；这两个卡可以是其中一个卡固定在机械连接臂上，另一个卡沿机械连接臂上下滑动。
本发明的生物芯片测序装置的测序方法为，待测DNA模板和DNA聚合酶放置在DNA延伸基底面上，发光相关的生物酶和发光辅助物则放置在发光透明基片面上；在DNA延伸基底面上加入dNTP后，将上述两部分面对面进行接触压印，延伸反应所产生的焦磷酸从DNA延伸基底面转移到发光透明基片面上，并在该发光透明基片面上与发光相关生物酶和发光辅助物作用，放出有一定强度的光信号；该光信号由上述发光检测器检测。
该方法中DNA延伸基底面上放置的待测DNA模板是PCR扩增产物，或是滚环扩增产物，或其它任何形式的待测序列DNA；该待测DNA模板，可以直接把双链DNA固定在基底的面上，再经处理获得单链DNA，然后每一单链DNA再与相应的测序引物杂交；也可以是将双链DNA先处理成单链DNA后，再将其固定于延伸部分基底面上，每一单链DNA再与相应的测序引物杂交。DNA延伸反应所需要dNTP的加入方法为通过微量喷雾的方法进行加样，或分别从四个不同的印章上转印加样。发光透明基片面上的发光生物酶为荧光素酶，同时可以包括ATP硫酸化酶和腺苷三磷酸双磷酸降解酶中的一种或二种组成；发光辅助物为腺苷磷酰硫酸和荧光素。接触压印是将DNA延伸基底固定，用机械操作装置将化学发光透明基片面压印于DNA延伸基底面上；或反之将化学发光透明基片固定，用机械操作装置将DNA延伸基底面压印于化学发光透明基片面上。
有益效果本发明提出了一种新颖的分子印章测序方法，该方法是基于焦磷酸测序技术原理，将待测单链DNA序列与测序引物相结合，引物上每次碱基延伸都同一次化学发光信号相偶联，根据发光检测装置获得的所释放光信号的有无及强弱，可确定待测DNA序列。本发明与现有测序技术相比具有以下优点a.高通量。成千上万个待测DNA序列片段固定在基片上形成微阵列延伸DNA基片，因此，该法可实现对大量待测DNA序列的高通量和并行性测定。b.低成本。本方法无需耗用体积较多的反应液，而是将DNA聚合酶和三种发光相关酶及辅助物直接加到基片，且能够得到重复，从而减小了反应酶的用量、降低测序成本；核酸单体用微喷或压印的方法，也减少了原料的消耗。另外，待测DNA可以通过价格低廉的丙烯酰胺胶直接固定在延伸基片上。c.操作简便。该装置容易实现自动化，待测DNA无须标记也无须电泳，从而避免了繁琐的制胶、跑胶和扫描等过程。
图1是本发明提出的基于分子印章的焦磷酸测序装置示意图。
图2是本发明中DNA延伸基底面(11)正面示意图。
图3是加入一次dNTP各阵点DNA发生碱基延伸示意图。
以上的图中有DNA延伸基底1、DNA延伸基底面11、化学发光透明基片2、发光透明基片面21、机械连接臂3、发光检测器4、信号分析装置5、待测DNA模板6、DNA聚合酶7、DNA微阵点编号8、DNA碱基延伸个数9。
具体实施例方式
本发明基于焦磷酸测序原理，提出了一种基于生物芯片的分子印章测序装置和方法。首先，将化学修饰的扩增产物制备成单链DNA并与相应的测序引物杂交后，通过一定媒介固定于固体基底材料(如玻片、石英、金属、塑料、陶瓷、橡胶、凝胶、纸材、尼龙等之一，或由它们中的二种或多种组成的复合物)的表面上，(或将化学修饰的扩增产物先固定于基片后再制备成单链DNA，并与相应的测序引物杂交)，再将DNA聚合酶放置于该基底上，构成含有待测序DNA模板微阵列DNA延伸基底；再通过微量喷雾或压印方法将四种dNTP核苷酸之一均匀喷洒或压印于DNA延伸基底表面，在DNA聚合酶的作用下，延伸基底上的测序引物若发生碱基的延伸，在基底的延伸位置产生焦磷酸基团。然后将化学发光所需的酶及辅助物加到另一个反应基片上(或中)；当延伸基底与加有发光酶的基片通过接触压印后，焦磷酸基团转移进入加有发光酶的基片，就会在相应的位置上有一定强度的化学发光信号释放，通过发光检测装置就可以实时检测到该信号的有无及强弱。当四种dNTP依次循环加入该系统中，就可以达到对延伸基底上每一阵点的DNA序列进行准确全面分析目的。
本发命中生物芯片测序装置的测序方法，其特征在于待测DNA模板和DNA聚合酶放置在DNA延伸基底面11上，发光相关的生物酶和发光辅助物则放置在发光透明基片面21上；在DNA延伸基底面11上加入dNTP后，将上述两部分面对面进行接触压印，延伸反应所产生的焦磷酸从DNA延伸基底面11转移到含有发光相关酶和发光辅助物的发光透明基片面21上，并在发光相关酶和发光辅助物的基片面21与发光相关酶和发光辅助物作用，放出有一定强度的光信号；该光信号由上述发光检测器4检测。
DNA延伸基底面11上待测DNA模板6可以是PCR扩增产物，也可以是滚环扩增产物，或其它任何形式的待测序列DNA。待测DNA的固定方式，可以是直接把扩增DNA产物固定在基底面，再经一定处理获得单链DNA，然后每一单链DNA再与相应的测序引物杂交；也可以是将扩增DNA产物先在基底外处理成单链DNA后，再将其固定于基片上，然后单链DNA再与测序引物杂交。单链DNA的制备方法可以是通过丙烯酰胺凝胶固定丙烯酰胺修饰的扩增产物后，经碱变性在去除非固定的单链DNA获得；也可以是链霉亲和素修饰的磁珠固定有生物素修饰的扩增产物后；也可以是通过链霉亲和素修饰的葡聚糖微珠固定有生物素修饰的扩增产物后，经碱变性在去除非固定的单链。该部分所述的DNA聚合酶可以是Klenow Fragmentpolymerase(exo-)，也可以是经点突变的测序酶Sequenase。
DNA延伸反应所需要dNTP(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)的加入方法为通过微量喷雾的方法进行加样，或分别从四个不同的印章上转印加样。
化学发光基片面21上放置有发光相关的生物酶和发光相关的辅助物。例如，在化学发光透明基片面上放置有ATP硫酸化酶和腺苷磷酰硫酸、荧光素酶和荧光素、以及腺苷三磷酸双磷酸降解酶等三种发光相关的酶和发光相关的辅助物的组合，或在化学发光透明基片面上放置有ATP硫酸化酶和腺苷磷酰硫酸、荧光素酶和荧光素等二种发光相关的生物酶和发光相关的辅助物的组合，或由荧光素酶与和荧光素组成。其中ATP硫酸化酶、荧光素酶以及腺苷三磷酸双磷酸降解酶等为发光相关的生物酶。腺苷磷酰硫酸和荧光素为发光相关的辅助物。
上述DNA延伸基底面11和化学发光基片面21的接触压印就是将DNA延伸基底1固定，用机械操作装置将化学发光透明基片面21压印于DNA延伸基底面11上；或反之将化学发光透明基片2固定，用机械操作装置将DNA延伸基底面11压印于化学发光透明基片面21上。
例1.用滚环扩增产物对50个DNA片段进行序列测定。
1.针对50个DNA片段分别用相应的限制性内切酶进行酶切，并将酶切片段中的一条链在靶DNA的作用下与一通用适配器(含有36碱基的DNA序列)连接成环状DNA。
2.用一个18碱基的通用扩增反向引物(5’端有丙烯酰胺修饰且与适配器3’端18碱基互补)和另一18碱基的通用扩增正向引物(与适配器5’端18bps互补)分别对上述环状DNA进行双引物滚环扩增；然后将滚环扩增产物与丙烯酰胺凝胶溶液混合，并用芯片点样仪将50个处理过的样品点在玻璃片上，并聚合成凝胶点阵，制备成测序用的微阵列芯片，见图2所示；再通过碱变性、电泳和冲洗，将非固定的DNA，引物，单链环及其它杂质去除，便得到DNA延伸微阵列；3.用通用测序引物(与扩增正向引物序列相同)与上述延伸基底面上的待测单链DNA序列杂交，并电泳洗除DNA模板上多余的测序引物。
4.将DNA聚合酶均匀放置于延伸基底的DNA微阵列上，同时将发光相关酶(ATP硫酸化酶、荧光素酶以及腺苷三磷酸双磷酸酶)和发光辅助物(腺苷磷酰硫酸)固定于另一透明的玻璃发光基片上。
5.将适量dNTP之一的脱氧核糖核苷酸反应液通过微量喷雾分散在延伸基底面的DNA微阵列上。若该次加入的dNTP与模板上相应位置DNA序列的最靠近测序引物的碱基互补，此时该碱基与待测DNA结合的测序引物在DNA聚合酶的作用下发生聚合延伸反应，同时产生等摩尔的焦磷酸盐。
6.迅速将DNA延伸基底面压印于另一发光透明基片上，使焦磷酸盐转移到发光透明基片面上。在ATP硫酸化酶和荧光素酶等的协同作用下，则会产生相应强度的荧光信号释放。通过在发光透明基片另一面的CCD成像，对每个阵点荧光的有无和强度的检测，就可以确定该dNTP在某个阵点是否发生聚合以及引物延伸碱基的个数。图3是在加入一次dNTP后，分子印章芯片每个阵点上的引物发生碱基延伸反应的示意图。图中横坐标表示该阵点序号，纵坐标表示碱基延伸个数。该图表示，在该次加入dNTP反应液后，阵点1、4、6、7、9、12……等发生了一个碱基的延伸；阵点3、11……等发生了二个碱基的延伸；阵点8……等发生了三个碱基的延伸；阵点2、5、10、13……等则没有发生碱基的延伸。
7.将DNA延伸基片上多余的dNTP去除。
8.重复步骤5至7，将四种不同的dNTP依次循环加入延伸基片，并记录每次NTP发生聚合所释放光信号。当四种单体dATP、dGTP、dCTP和dTTP反应液体依次循环加入微阵列芯片后，则可以同时对微阵列上每个DNA片段进行序列测定。例如，第一个阵点在dATP、dGTP、dCTP和dTTP第一次循环中依次通过后，分别发生了两个碱基的聚合、零个碱基的聚合、一个碱基的聚合和四个碱基的聚合。由此，得到测序引物上发生延伸的七个碱基为5′-AACTTTT-3′，从而确定该阵点DNA碱基组成为5′-AAAAGTT-3′，最终经过若干次循环后就可以得到第一个阵点上待测DNA全部序列。同理可以获得到其它各阵点DNA序列。最后综合反应芯片每个阵点上若干次反应结果，便可以得到延伸基片上每个阵点DNA序列组成，从而实现了50个DNA；片段的并行高通量测序。
例2.利用PCR产物对100个SNP基因型进行检测。
1.首先，提取人的基因组DNA，并通过PCR技术，获得100个分别含有不同SNP位点的PCR扩增产物片段。在上述PCR产物的反向引物的5’端用生物素修饰，且使该反向引物的前18个碱基序列相同，余下的碱基为每个待扩增片段的特异序列部分。
2.该100个PCR产物分别用链霉亲和素修饰的磁珠进行固定，再用NaOH进行变性处理，缓冲液冲洗，获得单链DNA。
3.用带有磁性的DNA延伸基底面将上述单链DNA固定成10×10阵列。
4.用通用测序引物与该延伸基底上的微阵列DNA进行杂交，并将多余引物冲洗干净。
5.将DNA聚合酶均匀涂抹于DNA延伸基底的微阵列延伸基底上，同时将发光相关酶和发光辅助物置于另一发光透明基片上。
6.将适量dNTP用压印方法转移到延伸DNA微阵列基片上，并将DNA延伸基底面与另一发光透明基片进行接触压印。
7.将上述微阵列DNA延伸基底上每一阵点DNA产生光信号的有无及强弱用发光检测装置进行检测并记录，同时通过软件进行分析给出每个阵点所延伸碱基的个数。
8.再分别将dTTP，dATP和dGTP重复步骤6和7的操作。
9.这样将四种dNTP依次循环次压印于延伸基底面的DNA上，并记录每次每个阵点所释放光信号的强弱，再通过软件的综合分析给出每个阵点DNA的序列。
10.最后对100个SNP位点的突变类型进行判断。
例3.用滚环扩增产物进行大肠杆菌全基因组DNA序列的再测定。
1.提取大肠杆菌的基因组DNA，并通过超声方法片段化。通过将DNA片段中的一端在靶DNA的作用下与一通用5’端磷酸的适配器(含有36碱基的DNA序列)结合，使DNA片段中的一条链连接成环状DNA，并进行适当的稀释，形成单一环状DNA的大肠杆菌的全基因组测序模板溶液。
2.用一个18碱基的通用扩增反向引物(5’端有丙烯酰胺修饰且与适配器3’端18碱基互补)分别对上述环状DNA进行双引物滚环扩增；然后将滚环扩增产物与丙烯酰胺凝胶溶液混合，均匀地铺展在玻璃片上，并聚合成超薄的凝胶层，制备成含有大量单分子多拷贝的滚环产物微阵列芯片。
3.将通用测序引物与微阵列芯片上的单分子DNA模板杂交，并电泳洗除DNA模板上多余的测序引物，便得到DNA延伸微阵列。
4.将DNA聚合酶均匀放置于延伸基底的DNA微阵列上，同时将发光相关酶(ATP硫酸化酶、荧光素酶以及腺苷三磷酸双磷酸酶)和发光辅助物(腺苷磷酰硫酸)固定于另一透明的玻璃发光基片上。
5.将适量dNTP之一的脱氧核糖核苷酸反应液通过微量喷雾分散在DNA微阵列延伸基底面上。若该次加入的dNTP与模板上相应位置DNA序列的最靠近测序引物的碱基互补，此时该碱基与待测DNA结合的测序引物在DNA聚合酶的作用下发生聚合延伸反应，同时产生等摩尔的焦磷酸盐。
6.迅速将延伸基底面压印于另一发光透明基片上，使焦磷酸盐转移到发光透明基片面上，在ATP硫酸化酶和荧光素酶等的协同作用下，则会产生相应强度的荧光信号释放。通过在发光透明基片另一面的CCD成像，对每个阵点荧光的有无和强度的检测，就可以确定该dNTP在某个阵点是否发生聚合以及引物延伸碱基的个数。
7.将DNA延伸基底面上多余的dNTP去除。
8.重复步骤5至7，将四种不同的dNTP依次循环加入延伸基面，并记录每次dNTP发生聚合所释放光信号。当四种单体dATP、dGTP、dCTP和dTTP反应液体依次循环加入微阵列芯片后，则可以同时对微阵列上每个DNA片段进行序列测定。最后综合反应芯片每个阵点上若干次反应结果，便可以得到延伸基底上每个单分子DNA序列组成，从而实现了全基因组DNA片段的高通量并行测序。通过参考已知的大肠杆菌的基因组序列，进行被测序DNA片段的组装，实现大肠杆菌的全基因组再测序。
权利要求
1.一种生物芯片测序装置，其特征在于该装置由DNA延伸基底(1)、化学发光透明基片(2)和机械连接臂(3)三部分构成；其中，DNA延伸基底(1)、化学发光透明基片(2)分别固定在机械连接臂(3)上；DNA延伸基底(1)为一固体材料基底，在DNA延伸基底(1)上与化学发光透明基片(2)相对的一面为放置DNA及聚合酶的DNA延伸基底面(11)，在化学发光透明基片(2)上与DNA延伸基底(1)相对的一面为放置发光相关酶和发光辅助物的发光透明基片面(21)，在化学发光透明基片(2)的另一面的外部设有发光检测器(4)，发光检测器(4)的输出端接信号分析装置(5)。
2.根据权利要求1所述的生物芯片测序装置，其特征在于DNA延伸基底(1)的材料为玻璃、石英、金属、塑料、陶瓷、橡胶、凝胶、纸材、尼龙之一，或由它们中的二种或多种组成的复合物，且DNA延伸基底(1)与化学发光透明基片(2)相对的一面为一水平面；在DNA延伸基底(1)上不与化学发光透明基片(2)相对的一面，放置温度调控装置，如加热电极、半导体温控器件、光学加热、气流控温。
3.根据权利要1求所述的生物芯片测序装置，其特征在于放置发光相关酶和发光辅助物的基片面(21)的材料为玻片、橡胶、石英、凝胶等材料之一，或由它们中的二种或多种组成的复合物。
4.根据权利要求1所述的生物芯片测序装置，其特征在于发光检测器(4)为光电耦合器件CCD、光电倍增管PMT和互补性氧化金属半导体CMOS中的一种。
5.根据权利要求1所述的生物芯片测序装置，其特征在于机械连接臂(3)上有两个卡(31)，它们分别用来固定DNA延伸基底(1)、化学发光透明基片(2)；这两个卡可以是其中一个卡固定在机械连接臂(3)上，另一个卡沿机械连接臂(3)上下滑动。
6.一种如权利要求1所述的生物芯片测序装置的测序方法，其特征在于待测DNA模板和DNA聚合酶放置在DNA延伸基底面(11)上，发光相关的生物酶和发光辅助物则放置在发光透明基片面(21)上；在DNA延伸基底面(11)上加入dNTP后，将上述两部分面对面进行接触压印，延伸反应所产生的焦磷酸从DNA延伸基底面(11)转移到发光透明基片面(21)上，并在该发光透明基片面(21)上与发光相关生物酶和发光辅助物作用，放出有一定强度的光信号；该光信号由上述发光检测器(4)检测。
7.根权利要求6所述的生物芯片测序装置的测序方法，其特征在于该方法中DNA延伸基底面(11)上放置的待测DNA模板(6)是PCR扩增产物，或是滚环扩增产物，或其它任何形式的待测序列DNA；该待测DNA模板，可以直接把双链DNA固定在基底的面上，再经处理获得单链DNA，然后每一单链DNA再与相应的测序引物杂交；也可以是将双链DNA先处理成单链DNA后，再将其固定于延伸部分基底面上，每一单链DNA再与相应的测序引物杂交。
8.根据权利要求6所述的生物芯片测序装置的测序方法，其特征在于DNA延伸反应所需要dNTP的加入方法为通过微量喷雾的方法进行加样，或分别从四个不同的印章上转印加样。
9.根据权利要求6所述的生物芯片测序装置的测序方法，其特征在于发光透明基片面(21)上的发光生物酶为荧光素酶，同时可以包括ATP硫酸化酶和腺苷三磷酸双磷酸降解酶中的一种或二种组成；发光辅助物为腺苷磷酰硫酸和荧光素。
10.根据权利要求6所述的生物芯片测序装置的测序方法，其特征在于接触压印是将DNA延伸基底(1)固定，用机械操作装置将化学发光透明基片面(21)压印于DNA延伸基底面(11)上；或反之将化学发光透明基片(2)固定，用机械操作装置将DNA延伸基底面(11)压印于化学发光透明基片面(21)上。
全文摘要
分子印章测序装置和测序方法涉及一种基于焦磷酸测序原理的方法，该装置是包括DNA延伸部分、化学发光部分和机械连接三部分。该分子印章测序方法是将滚环扩增单链DNA模板或PCR扩增的单链模板和DNA聚合酶固定在的DNA延伸基底的一面；而化学发光相关酶、化学发光辅助物则固定于发光透明基片的一面；光信号检测装置则置于发光透明基片的另一面。当延伸基底面与加有发光酶的透明发光基片接触压印后，焦磷酸基团转移进入加有发光酶的发光透明基片，就会在该基片的相应位置上释放一定强度的化学反应光信号，通过发光检测装置就可以实时检测到该信号的有无及强弱。当四种dNTP单核苷酸依次循环加入该系统中，就可以达到对DNA延伸基底面上每一DNA序列进行分析测序。
文档编号C12Q1/68GK1944674SQ200610096538
公开日2007年4月11日 申请日期2006年9月30日 优先权日2006年9月30日
发明者陆祖宏, 潘志强, 肖鹏峰 申请人:东南大学