一种具有免疫调节活性的六安瓜片多糖及其制备方法与应用

本发明涉及一种具有免疫调节活性的六安瓜片多糖及其制备方法与应用，属于食品及医药技术领域。

背景技术：

免疫是人体重要的生理功能，依靠这种功能机体能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏、排斥进入机体的异源性物质，或自身产生的损伤及变异细胞，以维持人体健康。1962年walford提出免疫衰老学说，认为免疫功能的衰退是造成机体衰老的重要因素，随着年龄的增长，免疫器官老化、免疫细胞数目减少，机体的免疫功能逐渐减弱，感染性疾病、肿瘤发病率会逐渐增高。免疫功能的下降还会进一步加速机体的衰老。

提高人体免疫功能的药物在调节免疫活性的同时也会带来众多副作用，如抗药性、药物依赖性、致畸致癌性等。因而，寻找一种天然高效、无毒性的机体免疫调节剂是当前研究者关注的热点研究方向。随着人们对天然活性物质研究的逐渐深入，多糖被越来越多的研究者关注，近些年来绿茶多糖、红茶多糖等均被证实具有良好的免疫调节功效。

六安瓜片简称瓜片、片茶，是中华传统历史名茶，也是中国十大名茶之一，其产自安徽省六安市大别山一带，为绿茶特种茶类。在世界所有茶叶中，六安瓜片是唯一无芽无梗的茶叶，由单片生叶制成。去芽不仅保持单片形体，且无青草味；梗在制作过程中已木质化，剔除后，可确保茶味浓而不苦，香而不涩。作为地方特色生物质资源，目前该种绿茶多糖的免疫活性尚未有报道，因此具有潜在地研究开发价值。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种具有免疫调节活性的六安瓜片多糖及其制备方法与应用。本发明发现的六安瓜片多糖具有良好的免疫调节活性，体外免疫活性检测六安瓜片多糖在25-400μg/ml时对raw264.7巨噬细胞均无明显的细胞毒性，且能大幅增加raw264.7巨噬细胞no释放量，激活免疫细胞活性，具有重要的研究和开发利用前景。

本发明为实现发明目的，采用如下技术方案：

一种具有免疫调节活性的六安瓜片多糖，其分子量为2.35×10⁵da，红外光谱显示其具有显著的多糖红外特征吸收峰。

本发明具有免疫调节活性的六安瓜片多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将六安瓜片茶叶经粉碎机粉碎后，过80目筛，得粉料；

(2)将所得粉料在50-80℃无水乙醇中浸泡处理2-4h，纱布过滤、真空干燥，得滤渣；

(3)按料液比1g:10-40ml，将所得滤渣在温度为50-100℃的热水中浸提1-5h，重复2-3次，合并提取液；

(4)将步骤(3)所得提取液浓缩至体积的1/3-1/10，向所得浓缩液中加入乙醇至乙醇最终的体积浓度为75-90％，然后4℃静置8-12h，5000-8000rpm离心10-30min，收集沉淀；

(5)将步骤(4)所得沉淀用水溶解后，离心去除不溶物，再经冷冻干燥，获得六安瓜片粗多糖；

(6)将步骤(5)所得六安瓜片粗多糖用去离子水配成浓度为20-40mg/ml的粗多糖溶液，离心后经0.22μm滤膜过滤，所得截留溶液置于deae-cellulose52离子交换柱中进行纯化，流动相为0.3mol/l的氯化钠溶液、流速为0.5-1.0ml/min；收集产物，再使用截留分子量为3.5kda-5.5kda的透析袋进行纯化后，冷冻干燥，即得六安瓜片多糖。

作为优选，步骤(2)中，所述真空干燥的温度为60-70℃、时间为2-4h。

作为优选，步骤(5)与步骤(6)中，所述离心的转速为7000-10000rpm。

本发明发现的六安瓜片多糖具有良好的免疫调节活性，可用于制备免疫调节剂。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明发现六安瓜片多糖对巨噬细胞raw264.7具有显著的免疫调节作用，对正常细胞无毒性，即使在高浓度条件下(400μg/ml)，巨噬细胞依然有较高的存活率；免疫活性检测显示，六安瓜片多糖在低浓度时(25μg/ml)也表现出明显的刺激效应，说明六安瓜片多糖能调节细胞免疫活性。目前尚未发现该种六安瓜片多糖的免疫活性报道。

2、经高效液相色谱(hplc)检测，本发明方法制备的六安瓜片多糖只有一个吸收峰，其分子量为2.35×10⁵da，免疫调节活性较强，可作为一种新型的免疫调节剂在保健类食品和药品中应用。

3、本发明的方法制备活性多糖效率高、活性稳定。

附图说明

图1为实施例1所得六安瓜片多糖的高效液相色谱图。

图2为实施例1所得六安瓜片多糖对巨噬细胞的毒性检测。从图2中可以看出，六安瓜片多糖对巨噬细胞raw264.7并无毒性作用，且在一定浓度范围内可以促进raw264.7巨噬细胞的生长。

图3为实施例1所得六安瓜片多糖对巨噬细胞分泌no释放量的检测。从图3中可以看出，与空白组相比，六安瓜片多糖对巨噬细胞分泌no具有明显的促进作用，说明六安瓜片多糖具有较强的免疫调节活性。

图4为实施例1所得六安瓜片多糖对巨噬细胞吞噬作用的检测。从图4中可以看出，六安瓜片多糖作用24h之后，巨噬细胞的吞噬作用明显上升且呈现浓度依赖性，与对照组相比，当六安瓜片多糖浓度为400μg/ml时，其吞噬活性显著增加且呈剂量依赖性。

图5为实施例1中巨噬细胞吞噬作用后的形态观察，其中图5a对应空白对照组、图5b对应1μg/mllps组，图5c对应100μg/ml六安瓜片多糖组、图5d对应400μg/ml六安瓜片多糖组。从图5中可以看出，空白对照组细胞呈圆形，具有正常的形态，而用六安瓜片多糖处理后细胞形态发生显著变化，可以清楚地看到，在细胞周围产生许多刺突，且具有浓度依赖性。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。以下内容仅仅是对本发明的构思所做的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施案例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式代替，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例以六安瓜片茶叶为原料，按如下步骤提取分离纯化六安瓜片多糖：

(1)将100g六安瓜片茶叶经粉碎机粉碎后，过80目筛，得粉料。

(2)将所得粉料在1l温度为70℃的无水乙醇中浸泡处理2h，纱布过滤、70℃真空干燥3h，得滤渣。

(3)按料液比1g:20ml，将所得滤渣在温度为90℃的热水中浸提2h，重复2次，合并提取液。

(4)将步骤(3)所得提取液浓缩至体积的1/10，向所得浓缩液中加入乙醇至乙醇最终的体积浓度为75％，然后4℃静置10h，10000rpm离心10min，收集沉淀。

(5)将步骤(4)所得沉淀用水溶解后，10000rpm离心10min去除不溶物，再经冷冻干燥，获得六安瓜片粗多糖。

(6)将步骤(5)所得六安瓜片粗多糖用去离子水配成浓度为40mg/ml的粗多糖溶液，10000rpm离心1min，0.22μm滤膜过滤，所得截留溶液置于deae-cellulose52离子交换柱中进行纯化，流动相为0.3mol/l的氯化钠溶液、流速为0.75ml/min；收集产物，再使用截留分子量为3.5kda的透析袋进行纯化后，冷冻干燥，即得六安瓜片多糖。

图1为本实施例所得六安瓜片多糖的高效液相色谱图，从图中可以看出：多糖样品存在保留时间为5.45min的单一吸收峰，通过测定与计算得出其分子量为2.35×10⁵da。

1、细胞毒性测定

将六安瓜片多糖用生长培养基稀释为不同浓度。将raw264.7细胞在生长培养基中于37℃培养，然后接种至96孔板(1×10⁴细胞/孔)中，并在96孔板中分别加入递增浓度的100μl六安瓜片多糖(25-400μg/ml)进行处理。同时以1μg/ml的lps作为阳性对照组。

孵育24h后，采用mtt法测定细胞存活率：首先除去细胞上清液，向每个孔中加入100mlmtt溶液(0.5mg/ml)并再温育4h。接下来，弃去上清液并向细胞培养物中加入100μldmso，然后避光摇动10min直至检测不到可见的颗粒物质。使用酶标仪测定570nm处的吸光度。六安瓜片多糖对巨噬细胞毒性作用结果如图2所示，在25μg/ml～400μg/ml浓度范围内，六安瓜片多糖对巨噬细胞无毒性作用，且具有促进作用。

2、no产生量测定(griess法)

将六安瓜片多糖用生长培养基稀释为不同浓度。将raw264.7细胞置于48孔板(1×10⁵个细胞/孔)中，于37℃预孵育24h。然后在孔板内分别加入递增浓度的200μl六安瓜片多糖(25-400μg/ml)进行处理24h。同时，在相同条件下，用lps(1μg/ml)处理细胞24h作为阳性对照组。然后，收集细胞培养物上清液并与等体积的griess试剂混合，室温下温育30min，酶标仪540nm下测定。结果如图3所示。

从图3可以看出，空白对照中no的产生远低于lps和六安瓜片多糖处理组的阳性对照，具有显著差异性。同时，不同浓度的六安瓜片多糖处理24h后，no的产生呈浓度依赖性，巨噬细胞的no释放量逐渐增加。实验结果表明六安瓜片多糖对raw264.7细胞具有显著地刺激作用，特别是对于no的产生有促进效应。

3、吞噬活性测定和形态学观察

通过中性红摄取测定法检测巨噬细胞的吞噬能力。将与六安瓜片多糖(25-400μg/ml)或lps(1μg/ml)混合的细胞(1×10⁵个细胞/孔)置于48孔板中，在37℃的培养箱(5％co2)中孵育24h。除去上清液，并将中性红溶液(v/v,0.05％)加入孔中并继续温育20min。然后，弃去上清液并用pbs洗涤细胞三次，以除去未被raw264.7细胞吞噬的多余中性红，加入裂解液，并在4℃下裂解2h。室温下孵育细胞过夜，在540nm处测定。采用倒置荧光显微镜观察吞噬中性红的raw264.7细胞形态。

从图4中可以看出，六安瓜片多糖处理组的吞噬指数在24h后显著高于空白对照，并且显示出良好的浓度依赖性。同时，最大浓度六安瓜片多糖处理组(400μg/ml)显著高于lps阳性对照组。表明六安瓜片多糖可以显著促进raw264.7细胞的吞噬能力。

为了进一步观察吞噬过程中的细胞形态变化，检测了raw264.7细胞的形态。从图5中可以看出，空白对照组细胞呈圆形，具有正常的形态(图5a)。然而，用lps(图5b，lps浓度为1μg/ml)及六安瓜片多糖(图5c-d，六安瓜片多糖浓度分别为100、400μg/ml)处理后的细胞形态发生了显著变化。可以清楚地看到，在细胞周围产生许多刺突，该结构有利于增加细胞与外部环境的接触面积，有助于吞噬作用。当六安瓜片多糖的浓度达400μg/ml时，刺突显著增加(图5d)，呈现出良好的浓度依赖性。

实施例2

本实施例以六安瓜片茶叶为原料，按如下步骤提取分离纯化六安瓜片多糖：

(1)将100g六安瓜片茶叶经粉碎机粉碎后，过80目筛，得粉料。

(2)将所得粉料在1l温度为70℃的无水乙醇中浸泡处理2h，纱布过滤、70℃真空干燥3h，得滤渣。

(3)按料液比1g:20ml，将所得滤渣在温度为80℃的热水中浸提3h，重复3次，合并提取液。

(4)将步骤(3)所得提取液浓缩至体积的1/10，向所得浓缩液中加入乙醇至乙醇最终的体积浓度为75％，然后4℃静置12h，8000rpm离心10min，收集沉淀。

(5)将步骤(4)所得沉淀用水溶解后，10000rpm离心10min去除不溶物，再经冷冻干燥，获得六安瓜片粗多糖。

(6)将步骤(5)所得六安瓜片粗多糖用去离子水配成浓度为40mg/ml的粗多糖溶液，10000rpm离心1min，0.22μm滤膜过滤，所得截留溶液置于deae-cellulose52离子交换柱中进行纯化，流动相为0.3mol/l的氯化钠溶液、流速为0.5ml/min；收集产物，再使用截留分子量为3.5kda的透析袋进行纯化后，冷冻干燥，即得六安瓜片多糖。

经测试，本实施例所得六安瓜片多糖的分子量为2.35×10⁵da，且具有良好的免疫调节活性。

实施例3

本实施例以六安瓜片茶叶为原料，按如下步骤提取分离纯化六安瓜片多糖：

(1)将100g六安瓜片茶叶经粉碎机粉碎后，过80目筛，得粉料。

(2)将所得粉料在2l温度为80℃的无水乙醇中浸泡处理3h，纱布过滤、70℃真空干燥3h，得滤渣。

(3)按料液比1g:30ml，将所得滤渣在温度为80℃的热水中浸提2h，重复3次，合并提取液。

(4)将步骤(3)所得提取液浓缩至体积的1/10，向所得浓缩液中加入乙醇至乙醇最终的体积浓度为80％，然后4℃静置8h，8000rpm离心20min，收集沉淀。

(5)将步骤(4)所得沉淀用水溶解后，10000rpm离心10min去除不溶物，再经冷冻干燥，获得六安瓜片粗多糖。

(6)将步骤(5)所得六安瓜片粗多糖用去离子水配成浓度为50mg/ml的粗多糖溶液，10000rpm离心1min，0.22μm滤膜过滤，所得截留溶液置于deae-cellulose52离子交换柱中进行纯化，流动相为0.3mol/l的氯化钠溶液、流速为1ml/min；收集产物，再使用截留分子量为3.5kda的透析袋进行纯化后，冷冻干燥，即得六安瓜片多糖。

经测试，本实施例所得六安瓜片多糖的分子量为2.35×10⁵da，且具有良好的免疫调节活性。

以上仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。