一种利用绣球菌子实体提取高含量维生素D2的方法与流程

本发明涉及绣球菌深加工技术领域，具体涉及一种利用绣球菌子实体提取高含量维生素d2的方法。

背景技术：

维生素d(vitamind，vd)是一组脂溶性类固醇衍生物，共有五种化合物，包括维生素d2（麦角骨化醇）和维生素d3（胆骨化醇）两种活性结构，其中vd2人体内不能合成，主要通过摄入蔬菜和膳食补充。

vd不仅在骨骼疾病（包括营养性佝偻病、软骨病、骨质疏松等）发挥重要作用。近年来随着临床研究的深入，vd在非骨骼疾病中也起到十分重要的作用。基础研究证实维生素d受体（vdr）广泛分布于体内的骨骼系统、胰岛β细胞、甲状旁腺、大脑、皮肤、前列腺、睾丸、心脏、骨骼肌、乳腺、肝脏、肺、大肠、肾脏及活化了的t、b细胞等各种组织细胞中，所以vd具有多种功能及组织细胞特异性，vd缺乏将会导致291种基因产物的减少。越来越多的研究发现补充vd在预防和治疗全因死亡率、心血管疾病及心血管病死亡率、代谢综合征（肥胖、糖耐量减低/糖尿病、脂代谢紊乱、高血压）、恶性肿瘤、感染、过敏性疾病及哮喘、生殖疾病、肠道疾病、精神及神经疾病、自身免疫性疾病、慢性肾病等诸多疾病均起到重要作用。

vd缺乏已成为全世界的公共健康问题，目前全球人群vd不足的发生率为30%～50%，数十亿人口，且呈逐年上升趋势，影响着人们生活质量。提高vd水平主要有3个途径：增加阳光照射，增加富含vd食物的摄入量，摄入vd营养素补充剂。

虽然化学合成的vd价格低廉，但随着人们对天然健康食品消费的持续喜好，天然vd不仅价格高，而且市场份额不断增大。其中天然vd2仅存在于真菌界，植物界和动物界中几乎没有麦角甾醇和vd2。

绣球菌，又名绣球菇，是非褶孔菌目、绣球菌科、绣球菌属。子实体中等至大形，肉质，由一个粗壮的柄上发出许多分枝，枝端形成无数曲折的瓣片，形似巨大的绣球而得名，因其具有超高的激活免疫能力，在日本有"梦幻神奇菇"之称，普通蘑菇生长在阴面，而绣球菇每天需要10h以上的照射，是世界上唯一的"阳光蘑菇"。绣球菌还含有麦角固醇，在阳光和紫外线照射下可转变为维生素d，能促进钙磷吸收，有利于骨骼形成，预防儿童佝偻病、成人骨质疏松症和骨质软化症。

现有技术中，公开号为cn201810107202.4的中国专利公开了一种提高食用菌中维生素d2的方法，利用多频段的脉冲强光对食用菌进行照射，将麦角固醇转换为维生素d2，但该方案一方面还未利用绣球菌提取维生素d，另一方面即使利用食用菌提取维生素d2，由于食用菌为颗粒装，紫外线照射穿透力有限，被照射的范围不能全面覆盖而使得维生素d2提取含量低。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种利用绣球菌子实体提取高含量维生素d2的方法，单位质量的绣球菌中维生素d2提取含量高、绣球菌子实体利用率大。

本发明的解决的技术方案是，一种利用绣球菌子实体提取高含量维生素d2的方法，包括以下步骤：

s1、取研磨过筛后的绣球菌子实体与水溶性纳米荧光材料混合，超声分散于蒸馏水中，得分散悬浊液，粉末状的水溶性荧光材料与绣球菌均匀混合后，20-50khz的超声波分散设备分散于蒸馏水中，使得绣球菌子实体粉末微粒均匀分散于水溶性纳米荧光材料的水溶液中；

s2、将所述分散悬浊液置于脉冲电场中，并在所述水溶性纳米荧光材料的激发波长下照射所述分散悬浊液，照射结束后，过滤取滤渣，得第一提取固形物，本方案中的脉冲电场为高压脉冲电场，作用于分散悬浊液，高压脉冲电场是把液态食品作为电解质置于容器内，与容器边缘的两个放电电极通过高压电流，产生电脉冲进行加工的方法，可瞬间使被处理细胞的细胞壁和细胞膜电位紊乱，改变其通透性，甚至可击穿细胞壁和细胞膜，使其发生不可逆破坏，细胞中组分流出，如在细胞膜内的麦角固醇、维生素d2、脂质、绣球菌蛋白、多糖等等，在细胞组分溶出的同时，其溶出组分也受到水溶性纳米荧光材料的激发波长下照射，本方案中的水溶性纳米荧光材料的激发波长为200-380nm，发射波长为280-400nm，使用的水溶性纳米荧光材料不限于水溶性量子点，符合波长段要求的荧光材料均可，均属于紫外光波段，而溶出的麦角固醇会在紫外光激发下，转换为维生素d2，由于紫外光在液体中的穿透力是逐渐减弱的，且在液体中表层的绣球菌子实体粉末微粒会阻挡内部绣球菌子实体粉末微粒接触到紫外光，但在方案中，绣球菌子实体粉末微粒是分散于含有水溶性纳米荧光材料的分散悬浊液中，当分散悬浊液被紫外光照射时，表层的或能被紫外光直接照射到的绣球菌子实体粉末微粒中的麦角固醇直接转换为维生素d2，而被遮盖的或者由于外部提供的紫外光穿透力不足而照射不到的绣球菌子实体粉末微粒由于分散于含有水溶性纳米荧光材料的分散悬浊液中，水溶性纳米荧光材料受到激发光的激发从而发射280-400nm的波长，使得被水溶性纳米荧光材料包围且收不到外部提供的紫外光照射的绣球菌子实体单个微粒也受到紫外光的辐射，绣球菌子实体紫外光的照射范围全面，麦角固醇转换为维生素d2的效率更高，另一方面，本方案采用绣球菌为对象提取维生素d2，与含有相同质量的麦角固醇的食用菌相比，可得到的维生素d2的产量更高，一方面是由于利用了上述转换方法，另一方面是由于普通蘑菇生长在阴面，而绣球菇每天需要10h以上的照射，是世界上唯一的"阳光蘑菇"，其本身的维生素d2含量较高，照射结束后，过滤得到的第一提取固形物中的成分即非水相物质包括：由麦角固醇转换的维生素d2、脂质、绣球菌蛋白、非水溶性固形物；

s3、利用碱液将所述第一提取固形物超声分散，并在脉冲电场的作用下，进行皂化反应，反应结束后取滤渣，得第二提取固形物，本步骤的脉冲电场作用于第一提取固形物，使得反应时振荡加剧，避免皂化反应在两相之间的界面进行，加速碱液向油脂的扩散速率，提高皂化反应对脂质的去除效率，碱液的ph也使得绣球菌蛋白变性称为絮凝物沉淀，反应结束后一同并入第二提取固形物中，此时，第二提取固形物中包括维生素d2、绣球菌变性蛋白、非水溶性固形物；

s4、将100%的乙醇溶液加入至所述第二提取固形物中，搅拌均匀后，过滤取滤液，得提取液，由于维生素d2不溶于水，易溶于乙醇、乙醚、丙酮等，利用乙醇做提取剂将维生素d2提取出来，而绣球菌变形蛋白和非水溶性固形物则被去除，得到维生素d2溶液；

s5、真空旋蒸干燥所述提取液去除乙醇，即得维生素d2提取物。

优选地，所述水溶性纳米荧光材料为水溶性cdse/zns量子点、水溶性cds/zns量子点、水溶性inp/zns量子点、水溶性znse/zns量子点中的一种或几种，本方案中的水溶性量子点采购于西安齐岳生物，采购的量子点为核壳型的荧光量子，水溶性通过在量子点外围包裹一层聚乙二醇peg而实现水溶性的，该类产品的发射波长在紫外区域280-400nm，激发波长为200-380nm，值得注意的是，本方案中的水溶性纳米荧光材料不限于水溶性量子点，也可以为发射波长在紫外区域280-400nm，激发波长为200-380nm其他荧光染料或者荧光粉等。

优选地，所述水溶性纳米荧光材料的激发波长为200-380nm，所述水溶性纳米荧光材料的发射波长为280-400nm，激发波长与发射波长均属于紫外波段，有利于绣球菌子实体中的麦角固醇转换为维生素d2。

优选地，所述绣球菌子实体的粒径为100-200目，细腻的绣球菌子实体粉末有利于分散至分散悬浊液中，增加绣球菌子实体接触紫外光照的接触面积。

优选地，所述步骤s2中，脉冲电场的电场强度为30-40kv/cm，脉冲宽度为6-12µs，本步骤中的脉冲电场的设置是为了细胞组分的溶出，因此所需电场强度较高。

优选地，所述碱液的ph值为9-10，此ph值下有利于皂化反应的进行同时使蛋白变形，本方案中的碱液可以为naoh溶液、koh溶液等。

优选地，所述皂化反应的温度为95-100℃，皂化时间为2-4h，皂化温度高于95℃，即蛋白质的变性温度，使得绣球菌中的蛋白质不可逆变性，以在步骤s3中同时去除绣球菌中的脂质和蛋白。

优选地，所述步骤s3中，脉冲电场的电场强度为20-30kv/cm，脉冲宽度为6-40µs，本步骤中的脉冲电场的作用为得反应时振荡加剧，避免皂化反应在两相之间的界面进行，加速碱液向油脂的扩散速率，提高皂化反应对脂质的去除效率，因此所需的脉冲电场相对来说弱而持久。

优选地，所述真空旋蒸干燥的温度为30-40℃，避免由于高热引发维生素d2的热不稳定性。

优选地，所述步骤s2与所述步骤s3之间还包括步骤s2.1：水洗所述第一提取固形物，去除可溶性固形物，为后续提纯提供杂质较少的原料。

本发明的有益效果在于：

1、本方案利用水溶性纳米荧光材料分散绣球菌子实体粉末微粒，实现被遮盖的或者由于外部提供的紫外光穿透力不足而照射不到的绣球菌子实体粉末微粒也受到紫外光的辐射，绣球菌子实体紫外光的照射范围全面，麦角固醇转换为维生素d2的效率高，因此提取含量高；

2、本方案采用绣球菌为对象提取维生素d2，与含有相同质量的麦角固醇的食用菌相比，可得到的维生素d2的产量更高；

3、本方案的脉冲电场作用于第一提取固形物时，使得反应时振荡加剧，避免皂化反应在两相之间的界面进行，加速碱液向油脂的扩散速率，提高皂化反应对脂质的去除效率，碱液的ph及皂化反应温度也使得绣球菌蛋白发生不可逆的变形，同时去除绣球菌中的脂质及绣球菌蛋白；

4、本方案中的脉冲电场作用于分散悬浊液时，瞬间使被处理细胞的细胞壁和细胞膜电位紊乱，改变其通透性，甚至可击穿细胞壁和细胞膜，使其发生不可逆破坏，细胞中组分如麦角固醇流出，流出的麦角固醇又在水溶性纳米荧光材料的激发波长的照射下即时转换为维生素d2，克服了麦角固醇因提取时间长或其他外部影响而造成的不稳定性氧化，保证了维生素d2的转换效率；

5、本方案使用的提取剂无毒无害，为后续制作维生素d2的深加工产品提供安全性保障。

说明书附图

图1为实施例1-4及对比例1-3所得的维生素d2提取物的纯度及提取含量的分析结果。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

一种利用绣球菌子实体提取高含量维生素d2的方法，包括以下步骤：

s1、取研磨过筛后的100目的100g绣球菌子实体与5µg水溶性纳米荧光材料混合，20khz超声分散于蒸馏水中，得分散悬浊液；

s2、将所述分散悬浊液置于脉冲电场的电场强度为30kv/cm，脉冲宽度为6µs的脉冲电场中，并在所述水溶性纳米荧光材料的激发波长下照射所述分散悬浊液，所述水溶性纳米荧光材料的激发波长为200-380nm，所述水溶性纳米荧光材料的发射波长为280-400nm，照射2h结束后，过滤取滤渣，得第一提取固形物，所述水溶性纳米荧光材料为水溶性cdse/zns量子点；

s3、利用ph值为9的碱液将所述第一提取固形物超声分散，并在脉冲电场的电场强度为20kv/cm，脉冲宽度为40µs的脉冲电场的作用下，进行皂化反应，皂化反应的温度为95℃，皂化时间为2h，反应结束后取滤渣，得第二提取固形物；

s4、将500ml的100%的乙醇溶液加入至所述第二提取固形物中，搅拌均匀后，过滤取滤液，得提取液；

s5、30℃下真空旋蒸干燥所述提取液，即得维生素d2提取物。

实施例2

一种利用绣球菌子实体提取高含量维生素d2的方法，包括以下步骤：

s1、取研磨过筛后的200目的200g绣球菌子实体与10µg水溶性纳米荧光材料混合，50khz超声分散于蒸馏水中，得分散悬浊液；

s2、将所述分散悬浊液置于脉冲电场的电场强度为40kv/cm，脉冲宽度为12µs的脉冲电场中，并在所述水溶性纳米荧光材料的激发波长下照射所述分散悬浊液，所述水溶性纳米荧光材料的激发波长为200-380nm，所述水溶性纳米荧光材料的发射波长为280-400nm，照射结束后，过滤取滤渣，得第一提取固形物，所述水溶性纳米荧光材料为水溶性cds/zns量子点；

s3、利用ph值为10的碱液将所述第一提取固形物超声分散，并在脉冲电场的电场强度为30kv/cm，脉冲宽度为30µs的脉冲电场的作用下，进行皂化反应，皂化反应的温度为100℃，皂化时间为4h，反应结束后取滤渣，得第二提取固形物；

s4、将500ml的100%的乙醇溶液加入至所述第二提取固形物中，搅拌均匀后，过滤取滤液，得提取液；

s5、40℃下真空旋蒸干燥所述提取液，即得维生素d2提取物。

实施例3

一种利用绣球菌子实体提取高含量维生素d2的方法，包括以下步骤：

s1、取研磨过筛后的150目的100g绣球菌子实体与5µg水溶性纳米荧光材料混合，40khz超声分散于蒸馏水中，得分散悬浊液；

s2、将所述分散悬浊液置于脉冲电场的电场强度为35kv/cm，脉冲宽度为10µs的脉冲电场中，并在所述水溶性纳米荧光材料的激发波长下照射所述分散悬浊液，所述水溶性纳米荧光材料的激发波长为200-380nm，所述水溶性纳米荧光材料的发射波长为280-400nm，照射结束后，过滤取滤渣，得第一提取固形物，所述水溶性纳米荧光材料；

s3、利用ph值为9.5的碱液将所述第一提取固形物超声分散，并在脉冲电场的电场强度为25kv/cm，脉冲宽度为6µs的脉冲电场的作用下，进行皂化反应，皂化反应的温度为98℃，皂化时间为3h，反应结束后取滤渣，得第二提取固形物；

s4、将500ml的100%的乙醇溶液加入至所述第二提取固形物中，搅拌均匀后，过滤取滤液，得提取液；

s5、35℃下真空旋蒸干燥所述提取液，即得维生素d2提取物。

实施例4

一种利用绣球菌子实体提取高含量维生素d2的方法，包括以下步骤：

s1、取研磨过筛后的200目的200g绣球菌子实体与10µg水溶性纳米荧光材料混合，50khz超声分散于蒸馏水中，得分散悬浊液；

s2、将所述分散悬浊液置于脉冲电场的电场强度为40kv/cm，脉冲宽度为6µs的脉冲电场中，并在所述水溶性纳米荧光材料的激发波长下照射所述分散悬浊液，所述水溶性纳米荧光材料的激发波长为200-380nm，所述水溶性纳米荧光材料的发射波长为280-400nm，照射结束后，过滤取滤渣，得第一提取固形物，所述水溶性纳米荧光材料为水溶性znse/zns量子点；

s2.1、水洗所述第一提取固形物；

s3、利用ph值为10的碱液将所述第一提取固形物超声分散，并在脉冲电场的电场强度为20kv/cm，脉冲宽度为40µs的脉冲电场的作用下，进行皂化反应，皂化反应的温度为100℃，皂化时间为4h，反应结束后取滤渣，得第二提取固形物；

s4、将500ml的100%的乙醇溶液加入至所述第二提取固形物中，搅拌均匀后，过滤取滤液，得提取液；

s5、30℃下真空旋蒸干燥所述提取液，即得维生素d2提取物。

对比例1

一种利用绣球菌子实体提取维生素d2的方法，包括以下步骤：

s1、取研磨过筛后200目的100g绣球菌子实体，20-50khz超声分散于蒸馏水中，得分散悬浊液；

s2、将所述分散悬浊液置于脉冲电场的电场强度为30-40kv/cm，脉冲宽度为6-12µs的脉冲电场中，并在200-400nm的紫外光照射所述分散悬浊液，照射结束后，过滤取滤渣，得第一提取固形物；

s2.1、水洗所述第一提取固形物；

s3、利用ph值为10的碱液将所述第一提取固形物超声分散，并在脉冲电场的电场强度为20-30kv/cm，脉冲宽度为6-40µs的脉冲电场的作用下，进行皂化反应，皂化反应的温度为95-100℃，皂化时间为2-4h，反应结束后取滤渣，得第二提取固形物；

s4、将500ml100%的乙醇溶液加入至所述第二提取固形物中，搅拌均匀后，过滤取滤液，得提取液；

s5、30-40℃下真空旋蒸干燥所述提取液，即得维生素d2提取物。

对比例2

一种利用绣球菌子实体提取维生素d2的方法，包括以下步骤：

s1、取研磨过筛后的200目的100g绣球菌子实体与5µg水溶性纳米荧光材料混合，20-50khz超声分散于蒸馏水中，得分散悬浊液；

s2、将所述分散悬浊液在所述水溶性纳米荧光材料的激发波长下照射所述分散悬浊液，所述水溶性纳米荧光材料的激发波长为200-380nm，所述水溶性纳米荧光材料的发射波长为280-400nm，照射结束后，过滤取滤渣，得第一提取固形物，所述水溶性纳米荧光材料为水溶性cdse/zns量子点；

s2.1、水洗所述第一提取固形物；

s3、利用ph值为10的碱液将所述第一提取固形物超声分散，并在脉冲电场的电场强度为30kv/cm，脉冲宽度为40µs的脉冲电场的作用下，进行皂化反应，皂化反应的温度为100℃，皂化时间为2h，反应结束后取滤渣，得第二提取固形物；

s4、将100%的乙醇溶液加入至所述第二提取固形物中，搅拌均匀后，过滤取滤液，得提取液；

s5、30℃下真空旋蒸干燥所述提取液，即得维生素d2提取物。

对比例3

一种利用绣球菌子实体提取维生素d2的方法，包括以下步骤：

s1、取研磨过筛后的100-200目的100g绣球菌子实体于20-50khz超声分散于蒸馏水中，得分散悬浊液；

s2、将所述分散悬浊液在200-400nm的紫外光照射反应，照射结束后，过滤取滤渣，得第一提取固形物；

s2.1、水洗所述第一提取固形物；

s3、利用ph值为10的碱液将所述第一提取固形物超声分散，并在脉冲电场的电场强度为20kv/cm，脉冲宽度为40µs的脉冲电场的作用下，进行皂化反应，皂化反应的温度为100℃，皂化时间为4h，反应结束后取滤渣，得第二提取固形物；

s4、将100%的乙醇溶液加入至所述第二提取固形物中，搅拌均匀后，过滤取滤液，得提取液；

s5、30℃下真空旋蒸干燥所述提取液，即得维生素d2提取物。

测试方法

维生素d2纯度的测定：利用液相色谱仪对实施例1-4及对比例1-3所得的维生素d2提取物进行分析，测定维生素d2提取物中所含维生素d2的浓度，液相色谱使用安捷伦1100高效液相色谱仪，色谱分离条件：色谱柱cosmosil5c18-ms-(4.6mm*250mm，5µm)，流动相：100%甲醇，流速：1.0ml/min，进样量：5ul，柱温：30min，二极管阵列检测器，检测波长：270nm，结果如图1所述，说明本方案中提取维生素d2的纯度高且稳定；

维生素d2提取含量的测定：将实施例1-4及对比例1-3所得的维生素d2提取物进行称重，并除以绣球菌子实体原材料的重量，即得维生素d2提取含量，结果如图1所示，证明本方案中维生素d2的提取含量高；

以上详细描述了本发明的具体实施例。

应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域的技术人员以本发明构思在现有技术上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，都应在本权利要求书所确定的保护范围内。