靶向癌胚抗原的小分子抗体的制作方法

本发明属于抗体领域。

背景技术：

肿瘤是危害人类健康的重要问题。目前肿瘤的治疗方法有手术治疗、放化疗治疗及单克隆抗体治疗等。手术治疗对晚期病人无效，且有严重术后创伤后遗症。常规放化疗由于缺乏靶向性，化学药物虽然具备对癌细胞的高度杀伤效力，却也常常误伤正常细胞，引起严重的毒副作用。单克隆抗体(通常为igg)虽然靶向性强，但是由于其分子量大，无法实现对结直肠癌等实体肿瘤深层治疗，疗效有限，同时大分子的单抗易引起机体对抗体的免疫反应。

小分子抗体，主要包括单链抗体(scfv)、fab片段、双链抗体(diabody)等。其中单链抗体是在免疫球蛋白(ig)重链可变区(vh)与轻链可变区(vl)之间用寡肽连接形成的“精简”的ig，大小约为igg的1/6。fab片段主要由vh、ch1和完整的轻链组成，大小为igg的1/3。两个单价抗体(例如scfv、fab片段)通过寡肽、二硫键等化学键相连，可形成二倍体(即二聚体)，称为双链抗体。小分子抗体的分子量较单克隆抗体分子量更低，不容易引起机体对抗体的免疫反应。因此小分子抗体逐渐成为目前肿瘤治疗的重点和未来发展趋势。

癌胚抗原(cea)是一种分子量为180-200kda多糖蛋白复合物，1965年首先由加拿大学者从结肠瘤和胎儿肠中提取的肿瘤相关抗原。cea作为一种常见的肿瘤标记物，被广泛用作各种cea靶标相关肿瘤的诊断和监测指标。凡内胚层来源的恶性肿瘤，如结肠、直肠、胃、肝、食道、胰腺等癌症病人血清中均有cea存在，并含量明显高于正常人。统计学资料表明大肠癌的cea表达率为83.3％，肝癌为80％，肺癌为76.6％，乳腺癌为63.2％。

目前以cea为抗原筛选得到的单克隆抗体对cea抗原的亲和性较低。maryamsalavatifar等报道了一种cea单链抗体、绿色荧光蛋白的融合蛋白，其对cea结合的半数有效浓度(ec50)为2.3×10^-8m，亲和力为cea单链抗体的一半(greenfluorescent-conjugatedanti-ceasinglechainantibodyforthedetectionofcea-positivecancercells.hybridomavolume30.number3，2011)，即其单链抗体的ce50为11.5nmol/l。陆文斌等报道了一种cea单链抗体，测定其ec50为8.2nmol/l(抗cea和ca19-9的单链抗体在hek293细胞中的融合表达及亲和力鉴定，肿瘤防治研究2019年第46卷第1期)。

技术实现要素：

本发明要解决的问题是：

提供一种对cea亲和力更高的新型cea单链抗体(96scfv)及其二倍体。单链抗体(96scfv)能与cea(癌胚抗原)特异性结合。在体外及体内可以与cea靶标相关细胞，如结直肠癌肿瘤细胞特异性结合。该抗体片段可通过化学键连接同位素分子，如¹²⁵i或¹⁸f。该抗体片段还可用于制备嵌合抗原受体，用于修饰t淋巴细胞。

本发明的技术方案如下：

一种靶向癌胚抗原的单链抗体，由重链可变区、接头和轻链可变区构成，其特征在于：

所述单链抗体的重链可变区序列如seqidno.3所示，轻链可变区序列如seqidno.4所示。

如前述的单链抗体，所述接头为丝氨酸残基和甘氨酸残基组成的接头，长10～20个氨基酸残基；

优选地，长15个氨基酸残基；

进一步优选地，其序列如seqidno.2所示。

一种单链抗体二倍体，所述二倍体是由2个前述单链抗体通过寡肽或二硫键连接成的分子。

一种表达靶向癌胚抗原的小分子抗体的基因，所述基因编码前述单链抗体。

优选地，基因的序列如seqidno.5所示。

一种结合癌胚抗原的标记分子，所述标记分子是在前述单链抗体，或前述二倍体抗体上通过化学键连接可被检测的原子或原子团，制备得到。

如前述的标记分子，所述可被检测的原子为放射性同位素；优选地，所述放射性同位素是¹²⁵i或¹⁸f。

一种嵌合抗原受体，包括依次相连的单链抗体、免疫球蛋白铰链区、跨膜区、激活结构域，所述单链抗体为前述单链抗体序列相同的肽段。

如前述的嵌合抗原受体，所述铰链区为igg4铰链区；

和/或，所述跨膜区为cd28跨膜区；

和/或，所述激活结构域由cd28及cd3ζ的胞内信号结构串联构成。

一种嵌合抗原受体t细胞，所述t细胞表达前述的嵌合抗原受体；

所述嵌合抗原受体的单链抗体、免疫球蛋白铰链区位于细胞膜外侧，所述跨膜区位于细胞膜中，所述激活结构域位于细胞膜内侧。

本发明的有益效果：本发明小分子抗体对cea的亲和力强，其中单链抗体对cea结合的ec50值为183.6ng/ml，结合其相对分子质量27486g/mol换算，可得ec50为6.7nmol/l，显著低于现有的cea单链抗体，即亲和力更强。

本发明的小分子抗体可用于cea阳性的肿瘤组织检测，亦可用于制备嵌合抗原受体以及嵌合抗原受体t细胞，检测能力和抗肿瘤效果均十分明显。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：纯化96scfv单链抗体及二倍体sds-page电泳图。

图2：elisa曲线图。

图3：[¹²⁵i]96scfv放射性化学检测峰图，纯度大于99％。

图4：[¹⁸f]96scfv放射性化学检测峰图，纯度大于95％。

图5：ls174t结直肠癌荷瘤鼠注射[¹⁸f]标记抗体后在不同时间点的显影结果。

图6：car-t体外杀伤实验中靶细胞裂解率统计。

具体实施方式

实施例1小分子抗体的筛选和纯化

1.抗体筛选

采用pcr方法扩增人、羊和鼠的抗体片段，进行序列重组，获得抗体片段库。将获得的抗体片段库连接到c端含有his标签和半胱氨酸的表达载体中，将表达载体转入大肠杆菌表达菌株，获得表达菌克隆。

使用膜菌落筛选方法对表达菌克隆进行筛选，获得对cea有高亲和力的小分子抗体表达菌，经测序，小分子抗体一条链的氨基酸序列(seqidno.1，n端-＞c端)如下：

划线部分为接头(seqidno.2)。接头序列位于n端一侧的序列(seqidno.3)为重链可变区(vh)，位于接头序列c端一侧的序列(seqidno.4)为轻链可变区(vl)。

2.抗体表达纯化

(1)将表达抗体片段的基因插入pet22表达质粒构建表达质粒pet22-96scfv。将含有表达质粒的表达菌接种到含有0.5-1.0％(w/v)葡萄糖、30-100mg/l氨苄青霉素yt培养基中，37℃培养10-20h。

表达抗体片段的基因序列(seqidno.5)如下：

(2)按照0.5-1.5％(v/v)的接种量，将步骤(1)所得菌液接种至含有30-100mg/l氨苄青霉素的yt培养基中，37℃培养至od600＝0.6-1.0。

(3)加入iptg至终浓度为0.05-0.15mmol/l，在25℃的条件下，诱导培养5-10小时；收集培养物。

(4)使用超声波或均质机破碎收集到的菌体细胞。0.5-2.0g菌体重悬于3-10ml平衡缓冲液，超声5-10s，间隔3-8s，运行50-100次或700-900pa均质2次。

(5)采用ni亲和填料分离纯化破碎后的上清液，即得cea小分子抗体。

3.抗体sds-page检测

本发明的小分子抗体有两种形式：单体(单链抗体)和二倍体(单体即序列如seqidno.1所述蛋白，二倍体是通过2个序列如seqidno.1所述蛋白末端半胱氨酸通过二硫键相连形成的蛋白，为二倍体抗体)。

纯化小分子抗体样品分别用含还原剂的电泳加样缓冲液和不含还原剂的电泳加样缓冲液处理，然后使用12％分离胶，4.5％浓缩胶进行电泳。考马斯亮蓝染色过夜后脱色、拍照。结果如图1所示，右侧泳道(二倍体)为未经还原剂处理的纯化样品，包含单体和二倍体两种形式。

4.亲和性检测

第一步，100μl浓度为1ug/μl的cea抗原包被elisa检测孔，37℃孵育2小时；

第二步，pbst缓冲液洗板3次；

第三步，用含1％bsa的pbs溶液200ul/孔封闭，37℃孵育2h；

第四步，pbst缓冲液洗板3次；

第五步，抗原包被孔中加入100μl纯化样品，起始浓度25600ng/ml，抗体按4倍稀释法稀释，稀释至6.25ng/ml，做2个复孔(n＝2)，取平均，37℃孵育1h；

第六步；用含pbst洗涤缓冲液洗板3次，然后加入100μl含0.5％bsa的pbs稀释的抗his-hrp抗体偶联物(1∶2000)，37℃孵育1h；

第七步，用pbst洗涤缓冲液洗涤孔板5次，向孔内加入100μltmb试剂，37℃显色5分钟，加入50μl1nhcl终止显色反应；

第八步，elisa酶标仪于450nm波长读数，用吸光值作纵坐标，抗体浓度对数作横坐标，绘制亲和曲线图。

elisa结果(见图2)表明，本发明抗体片段的ec50值为183.6ng/ml，该小分子抗体与cea抗原有特异性结合。

实施例2同位素标记的小分子抗体用于cea阳性细胞、组织的检测

将小分子抗体连接可检测的原子或原子团，能进行cea阳性细胞、组织的检测，临床上可用于cea阳性肿瘤的显影。

本实施例将实施例1的小分子抗体进行放射性同位素标记，进行cea阳性细胞、组织的特异性检测。

一、¹²⁵i标记

1.同位素标记小分子抗体的制备

50μgiodogen的小瓶，加入200μlpb涡旋震荡后弃去瓶中缓冲液，顺次加入96scfv，2mg/ml，0.20mg和100μlpb缓冲液(ph7.4，0.2m)，再小心加入¹²⁵i-nai溶液(高比活度9.5mci/mg，低比活度4.5mci/mg)，控制反应体系ph值7.4，室温反应5min，结束反应。使用g-25凝胶填料进行分离，即得纯化¹²⁵i同位素标记的cea小分子抗体，记作[¹²⁵i]96scfv。用whatmanno.1滤纸作为支持体，85％甲醇作为展开剂，在滤纸上点上样品，展开时间约40min，样品展开约10em，取出滤纸自然风干，测定标记同位素样品和游离同位素的rf值，计算样品放化纯，结果(见图3)表明，[¹²⁵i]96scfv纯化后放化纯度＞99％。

2.对ls174t细胞特异性反应

消化ls174t(特异性组，cea阳性的肿瘤细胞)、a549(非特异性组，cea阴性的肿瘤细胞)、bmscs(阴性对照组，cea阴性的正常细胞)细胞，分别以800rpm，离心5min后用pbs洗1遍，重悬于培养基中。将三种细胞悬液1ml(9×10⁵个细胞)分别加入反应管中，分别设立3个平行样品。反应管中分别加入1μci的[¹²⁵i]96scfv。在37℃水浴中震荡孵育1.5h。用pbs洗去未结合的[¹²⁵i]96scfv(离心法，1000rpm，洗2次)。γ计数仪测定三种细胞结合的[¹²⁵i]96scfv放射性计数以及总放射性计数。

结果如表1所示，[¹²⁵i]96scfv和ls174t肿瘤细胞有特异性结合。

表1不同细胞表现出放射性的比例

二、¹⁸f标记

1.同位素标记小分子抗体的制备

回旋加速器生产出的¹⁸f^-水溶液在氦气正压作用下，传到氟离子收集瓶中。在氮气压力下，¹⁸f^-水溶液流经qma，并被qma捕获。用适量k222溶液淋洗qma，将qma上的¹⁸f^-淋洗进反应管中，并升温至110-120℃进行第一次除水。干燥后继续加入2ml无水乙腈进行第二次除水。干燥结束加入sfb前体的乙腈溶液，加热密闭反应。反应10min冷却至室温后加入一定量的naoh溶液，加热反应20min后加入hcl中和。混合液通过c-18柱转移至第二个反应管，加入一定量的tstu，反应5min后加压通过预先活化好的c-18柱。用20ml超纯水分两次洗涤c-18柱，再用1.2ml乙醇洗脱c-18得¹⁸f-sfb粗品。取一定量前体96scfv与西林瓶中，加入一定量¹⁸f-sfb粗品后，加入碱调节ph到9左右，37℃反应20min后，加入预先活化好的pd-10柱，纯化除去小分子化合物，得到纯品[¹⁸f]96scfv。通过tlc分析，检测放射性化学纯度。

结果(见图4)表明，[¹⁸f]96scfv纯化后放化纯度＞95％。

2.结直肠癌荷瘤鼠体内显影实验

选用ls174t结直肠癌荷瘤鼠，放射性药物经生理盐水稀释后达到给药剂量要求(0.1ml，200μci)，每只荷瘤鼠经尾静脉注射[¹⁸f]96scfv0.1ml，约200μci。给药后经动态扫描1h，然后在2h、4h、6h三个时间点分别进行静态扫描10min。

结果如图5所示，荷瘤小鼠的肿瘤部位表现出明显的放射性信号，表面本发明的抗体可以特异性结合cea，用于肿瘤显影。注射[¹⁸f]96scfv后扫描结果显示荷瘤小鼠肾脏和膀胱有放射信号，6小时后膀胱仍有微弱信号，是因为该单链抗体通过肾脏经由尿液排出体外。

本实施例的结果说明：将本发明的小分子抗体连接可检测的原子或原子团后，可以用于检测cea阳性的细胞或组织。

实施例3小分子抗体用于car-t治疗

car-t是嵌合抗原受体t细胞的简称，通常是将嵌合抗原受体表达于t细胞中得到的细胞，所述嵌合抗原受体分为三段，位于细胞膜外侧的是单链抗体和免疫球蛋白铰链区，位于细胞膜中的是跨膜区，位于细胞膜内侧的是激活结构域，当抗体结构域与抗原蛋白结合后，会使激活结构域激活，促进t细胞的活化和增殖，发挥t细胞的杀伤作用。

本实施例使用实施例1所得的单链抗体(96scfv)序列构建car-t细胞，其嵌合抗原受体由如下几个结构域组成：抗cea的单链抗体(96scfv)，igg4铰链区，cd28跨膜区，免疫共刺激信号分子cd28及cd3ζ的胞内信号结构串联构成。

用cea阳性的lovo细胞作为靶细胞，取3个car-t克隆419、422、425用于体外细胞杀伤评价，经未插入96scfv的t细胞(ct)处理和培养基(medium)处理的lovo细胞作为对照。效靶比5∶1，作用时间24h。

结果显示，克隆419、422、425均达到较高的细胞杀伤作用，杀伤率(裂解率)接近或超过60％，而ct组杀伤率不到10％(图6)。

本实施例的结果表明：本发明的抗体靶向cea能力强，且cea用于car-t时能起到优良的抗肿瘤作用。

综上，本发明的小分子抗体可特异性结合癌胚抗原，可用于cea阳性的肿瘤组织检测以及car-t的制备，在肿瘤诊断和治疗中具有良好的应用价值。

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<110>成都金昆生物科技有限公司

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