一种高效的人阴道壁组织单细胞悬液制备方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高效的人阴道壁组织单细胞悬液制备方法。


背景技术：

2.随着生物技术的不断发展，单细胞测序成为解析细胞网络最强有力的技术手段。单细胞测序技术通过在单细胞水平获得全基因组范围的表达谱，有助于发现罕见细胞类型，深入了解细胞的个体差异，获得更多更深层次的生物信息。同时，对单细胞进行分析还可以使人们更好的了解细胞群体中某些特殊的细胞功能。
3.通过对人阴道壁组织进行单细胞测序，能为解析人阴道壁组织细胞的细胞异质性以及功能特性带来革命性理解。人阴道壁组织中的细胞分型可能会被修改和扩展，并且人阴道壁组织中的细胞功能将更加明确。人阴道壁组织与盆底功能障碍性疾病密切相关，人阴道壁组织的结构和功能受损可能会引起盆腔器官脱垂、压力性尿失禁等盆底功能障碍性疾病。因此，单细胞测序对人阴道壁组织的解析，对盆底功能障碍性疾病的早期诊断和治疗具有深远的意义。
4.阴道壁组织的单细胞样本要达到上机测序要求，需要达到如下的质控标准：
5.(1)细胞总数＞2
×
105；
6.(2)细胞活力＞70％；
7.(3)细胞大小＜30μm
8.(4)单细胞悬液无杂质，细胞没有粘连。
9.但是，由于阴道壁组织本身的特性，制备阴道壁组织的单细胞样本时会遇到以下困难：
10.(1)阴道壁组织含大量的胶原纤维，消化后有大量的胶原纤维碎片，这些胶原碎片难以与消化下来的细胞分离，从而使阴道壁组织的单细胞样本含有较多的杂质；(2)阴道壁组织属于致密的结缔组织，难以消化得到足量的细胞用于单细胞测序；(3)由于要消化阴道壁组织中大量的胶原纤维，消化酶的作用时间通常较长，一般需要4
‑
6h，使得消化下来的细胞的活力较低，难以满足单细胞测序的上机要求。
11.因此，如何高效制备人阴道壁组织单细胞样本以满足测序要求，成为本领域亟需解决的问题。


技术实现要素：

12.本发明的目的就在于提供一种高效的人阴道壁组织单细胞悬液制备方法，以解决上述问题。
13.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种高效的人阴道壁组织单细胞悬液制备方法，包括以下步骤：
14.(1)组织块清洗；
15.(2)组织块碎解；
16.(3)离心：将破碎后的组织进行离心；
17.(4)酶解消化：加入胶原酶进行消化，消化时间为100
‑
180min，酶解时振荡；
18.(5)过滤：将经过消化后的样品采用200
‑
300目的细胞筛网进行过滤，收集滤液，然后将滤液进行离心，除去上清液；
19.(6)重悬细胞并去除死细胞，得到阴道壁组织单细胞悬液。
20.作为优选的技术方案：步骤(1)中，在盛有预冷的无血清培养基的培养皿中进行，清洗过程在2min内完成，并保持所述培养皿至于冰上。
21.作为优选的技术方案：步骤(2)中，将组织块剪成2
‑
4mm3的碎块，碎解过程在5min内完成，并在冰上操作。
22.作为优选的技术方案：步骤(3)中，离心方法为：4℃离心300
‑
800
×
g，5min。
23.作为优选的技术方案，步骤(4)中，所述胶原酶在37℃预热，并在37℃消化，消化时横向振荡。
24.作为优选的技术方案，步骤(5)中，采用细胞完全培养基终止消化，所用滤网300目。
25.作为优选的技术方案，步骤(5)中，室温离心500
‑
1000
×
g，8min。
26.作为优选的技术方案，步骤(6)中，采用pbs进行重悬，采用试剂盒去除死细胞。
27.本申请的发明人通过大量试验，经过较长时间的摸索，最后通过对消化酶的种类、消化酶的作用时间、滤网孔径、离心速度角度进行改进，通过这些适宜的条件之间相互协同，可以得到较多数量、较高活性、较少杂质的阴道壁组织单细胞悬液。
28.其中，本发明通过选择对阴道壁组织胶原纤维特异性较强的消化酶
‑
胶原酶i型，使得阴道壁组织的消化较为完全，从而获得了足量的细胞和较少的杂质，从而解决了现有技术存在的杂质多、不能得到足量细胞的问题；
29.本发明通过将消化酶的作用时间由4
‑
6h缩短至2
‑
3h,以及选择损伤程度低的胶原酶i型，以及使用去除死细胞试剂盒，有效地提高了细胞的活力。
30.与现有技术相比，本发明的优点在于：采用本发明的方法，可以在较短时间内，得到细胞数量5
×
105以上、细胞活性达到90％以上，杂质较少的阴道壁组织单细胞悬液；在制备效率方面，整个制备时间可以缩短1
‑
2h，时间缩短30％以上，是一种高效的制备方法。
附图说明
31.图1为实施例1所得悬液的明场细胞计数图；
32.图2为实施例1所得悬液的荧光细胞计数图；
33.图3为实施例5所得悬液的明场细胞计数图；
34.图4为实施例5所得悬液的荧光细胞计数图；
35.图5为实施例8所得悬液的明场细胞计数图；
36.图6为实施例8所得悬液的荧光细胞计数图；
37.图7为实施例9所得悬液的明场细胞计数图；
38.图8为实施例9所得悬液的荧光细胞计数图。
39.图中：1、死细胞；2、活细胞；3、细胞团；4、碎片。
具体实施方式
40.下面将结合附图对本发明作进一步说明。
41.实施例1
‑
9：
42.一种高效的人阴道壁组织单细胞悬液制备方法，包括以下步骤：
43.(1)实验前准备
44.小剪刀、小镊子用酒精喷擦干净，紫外照射15min，保证无菌操作；
45.(2)无血清培养基润洗组织
46.将阴道壁组织块取出放入盛有预冷的无血清培养基的培养皿中，反复润洗以去除组织表面的筋膜和血块；整个过程在2min内完成，同时保持盛有组织的培养皿在冰上操作；
47.(3)剪碎组织
48.将洗净的组织块转入1.5ml离心管，加入400μl预冷的无血清培养基，用小剪刀将组织块快速剪碎成3mm3的细小碎块，整个过程在5min内完成，同时保持盛有组织的离心管在冰上操作；
49.(4)组织离心
50.补充800μl预冷的无血清培养基，4℃离心,500
×
g，5min；吸去上清，不要扰动离心管底部的组织碎块沉淀；
51.(5)酶解液消化
52.加入3ml、37℃预热的消化酶(不同实施例的酶种类选择及消化时间见表1)，用宽口吸头将组织碎块和酶解液一起转移到新的15ml离心管，用封口膜封口；在37℃恒温箱中，平置离心管在水平旋转摇床上，振荡速度为95
‑
105rpm，不同实施例的震荡方向和振荡速度见表1，震荡孵育消化100
‑
180min，不同实施例的酶种类选择及消化时间见表1；
53.(6)中止反应并过滤
54.取出离心管，按1：5的比例加入细胞完全培养基终止消化，轻柔颠倒混匀，静置1min，选用不同孔径(不同实施例的目数选择见表1)的细胞筛网过滤消化后的细胞悬液，并用无血清培养基冲洗离心管和细胞筛网，收集滤出液；室温离心2000rpm，8min；吸去上清，不要扰动离心管底部的细胞沉淀；
55.(7)重悬细胞并去除死细胞
56.加入1.5ml pbs，轻柔重悬细胞，采用dead cell removal kit(miltenyi biotec)试剂盒(不同实施例是否选择试剂盒的情况见表1)去除死细胞后，得到阴道壁组织单细胞悬液；
57.所得的实施例所得的细胞数目和细胞活性见表1；
58.表1不同实施例的工艺条件及结果
[0059][0060]
表1中，“p”是指“胰酶”、“c”是指“胶原酶i型”、“m”是指“分钟”、“h”是指“小时”；“孔径”是指步骤(6)中细胞筛网的孔径；“方向”是指步骤(5)酶解时的振荡方向；“振速”是指步骤(5)酶解时的振荡速度，单位是“rpm”；“kit”是指“是否使用去除死细胞试剂盒”，“离速”是指第(6)步的离心速度，单位是“rpm”；“数目”是指最后所得的单细胞数目；“活性”是指最后所得的单细胞活性，单位是“％”。
[0061]
其中，实施例1、5、8和9所得悬液的明场和荧光细胞计数图分别如图1
‑
8所示，从图中可以看出：
[0062]
如图1
‑
4所示，由于没有选择适宜的工艺条件，实施例1、5所得悬液的明场和荧光下均只见少量细胞。如图5，7所示，由于选择了合适的工艺条件，实施例8、9所得悬液的明场下可见大量细胞。另外，如图6，8所示，利用calcein am/pi荧光染料对活细胞与死细胞染色后，活细胞被calcein am荧光标记，死细胞被pi标记，镜下可见，被标记的活细胞占多数，死细胞与细胞碎片较少，提示实施例8、9所得悬液中细胞活性较高。此外，从图6，8看出，相对于原有方法，实施例8、9所得悬液中杂质明显减少。
[0063]
对比例1：考察消化时间的影响
[0064]
本对比例以实施例9为基础，除了在消化方式方面，采用胶原酶i型分别采用2h、3.5h外，其余与实施例9相同，结果，采用2h时，所得细胞数目和活性分别为16205个，96％；采用3.5h时，所得所得细胞数目和活性分别为59612个，62％。
[0065]
对比例2：考察过滤细胞滤网孔径的影响
[0066]
本对比例以实施例9为基础，除了步骤(6)过滤时所用细胞滤网的孔径分别采用200目、350目外，其余与实施例9相同，结果，采用200目时，所得细胞数目和活性分别为49256个，96％；采用350目时，所得所得细胞数目和活性分别为57530个，91％；
[0067]
对比例3：考察振荡方向的影响
[0068]
本对比例以实施例9为基础，除了步骤(5)消化时采用纵向振荡外，其余与实施例9相同，结果，所得细胞数目和活性分别为12035个，96％。
[0069]
对比例4：考察振荡速度的影响
[0070]
本对比例以实施例9为基础，除了步骤(5)消化振荡速度分别为80rpm、110rpm外，其余与实施例9相同，结果，振荡速度为80rpm时，所得细胞数目和活性分别为45236个，96％；振荡速度为110rpm时，所得细胞数目和活性分别为52626个，91％。
[0071]
对比例5：考察离心速度的影响
[0072]
本对比例以实施例9为基础，除了步骤(6)离心速度分别为1500rpm、2500rpm外，其余与实施例9相同，结果，离心速度为1500rpm时，所得细胞数目和活性分别为49655个，96％；离心速度为2500rpm时，所得细胞数目和活性分别为58725个，92％。
[0073]
通过上述对比例可以看出：本发明的制备方法，最重要的是酶的选择、酶的消化时间和是否振荡消化；而过滤孔径、振荡速度、离心速度等的改变也能满足要求，但无法取得最佳的消化效果。
[0074]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。