蜱传脑炎病毒报告病毒TBEVNluc2A的构建方法及其应用

本发明涉及蜱传脑炎病毒(tbev)报告病毒的构建，特别涉及稳定表达含有nluc荧光素酶的报告病毒的构建及其活性检测。

背景技术：

在中国，第一例人类蜱传脑炎(tbe)病例于1943年被发现。tbe在中国的分布与其蜱媒的分布密切相关。我国tbe病例均为远东亚型，由全沟硬蜱传播。内蒙古大兴安岭、黑海龙江小兴安岭、吉林省长白山林区是东北地区典型的tbe疫区。西北地区的新疆天山北坡林区和阿尔泰南坡林区也有间歇性的tbe报告。此外，tbe在云南(中国西南部)和西藏(中国西部)也有报道。由于tbe在中国不是强制报告的传染病，缺乏对该病的监测，其发病率很可能被低估。并且该病有区域性、季节性、职业性等特征，因此增强我国对该病的检测和对tbev的相关研究以达到对该病的控制是必要且可行的。

蜱传脑炎病毒(tbev)是黄病毒蜱传类群中最重要的一种。tbev有一个约11千碱基长的正链rna基因组，基因组包括5'utr和3'utr以及一个开放阅读框(openreadingframe，orf)，基因组总共编码3414个氨基酸，并翻译成单个多蛋白，该多蛋白经共转录和转录后加工成三种结构蛋白(structuralprotein，sp)和七种非结构蛋白(non-structuralprotein，nsp)^[21]。其中，结构蛋白有c、prm和e蛋白，非结构蛋白有ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5。相比于其他黄病毒尤其是蚊媒病毒，蜱传病毒研究相对较少，很多功能是基于其他黄病毒的研究推理出的。

nluc是荧光素酶系统家族的最新成员，可用于生物发光应用，这种小荧光素酶是从深海虾中提取的，并经过人工优化的一种荧光素酶，它的底物是呋喃嗪。nluc分子量较小，且该系统显示出比fluc和rluc高150倍以上的活性，发光输出保持稳定，持续时间比其他的荧光素酶长。因此，在几种荧光素酶中，nluc基因在生物发光和报告基因的应用上都比其他荧光素酶更稳定、更灵敏。

技术实现要素：

本发明的目的是构建出含有nluc荧光素酶的蜱传脑炎病毒的报告病毒，使其可以在细胞中稳定表达，并且可以通过检测nluc荧光素酶信号来研究病毒毒力，可作为抗病毒药物筛选的有力工具。

本发明采用的技术方案是：蜱传脑炎病毒报告病毒tbevnluc2a的构建方法，包括如下步骤：

1)snabi-c38片段的克隆：以tbev感染性克隆为模板，引物1和引物2为特异性引物，pcr扩增蜱传脑炎病毒snabi-c38片段；所述引物1和引物2的序列为：

引物1：5’-tacgtattagtcatcgctattac-3’；

引物2：5’-gtgtgaagaccatcacgagtccatttggc-3’；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min。

2)p2a序列和nluc基因的连接：将p2a序列设计在引物上，并分两轮pcr将p2a序列连接到nluc基因上。

第一轮pcr：以nluc-pgemt为模板，nluc-f和p2anlucr1为引物进行pcr，扩增好目的片段后，回收目的条带。

引物nluc-f：

5’-atggtcttcacactcgaag-3’；

引物p2anlucr1：

5’-cagcaggctgaagttagtagctccgcttcccgccagaatgcgttcgcac-3’；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。

第二轮pcr：以第一轮pcr回收的目的条带为模板，nluc-f和p2anlucr2为引物进行pcr，扩增好目的片段后，回收目的条带。

引物nluc-f：

5’-atggtcttcacactcgaag-3’；

引物p2anlucr2：

5’-aggtccagggttctcctccacgtctccagcctgcttcagcaggctgaagttag-3’；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。

将第二轮pcr回收的目的条带连接到pgemt载体上，命名为nluc2apgemt。

3)nluc-p2a片段的克隆：以nluc2apgemt为模板，引物3和引物4为特异性引物，扩增出片段nluc-p2a，此时该片段与前后两部分有重叠序列；所述引物3和引物4的序列为：

引物3：5’-caaatggactcgtgatggtcttcacactcgaag-3’；

引物4：5’-cttcccggccataggtccagggttctcctc-3’；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min。

4)c1-aflⅱ片段的克隆：以tbevfl为模板，引物5和引物6为特异性引物，扩增出片段c1-aflⅱ；所述引物5和引物6的序列为：

引物5：5’-gaaccctggacctatggccgggaaggccattc-3’；

引物6：5’-cttaagcaacactccagtctgg-3’；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃2min30s为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。

5)构建snabi-c38-nluc-p2a-c1-aflⅱ片段：以引物1和引物6为特异性引物，步骤1)获得的snabi-c38片段、步骤3)获得的nluc-p2a片段和步骤4)获得的c1-aflⅱ片段为模板，通过重叠延伸pcr，将此三个片段连接在一起，得到snabi-c38-nluc-p2a-c1-aflⅱ片段；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃3min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。

6)含有nluc荧光素酶的tbev报告病毒的构建：将步骤5)获得的snabi-c38-nluc-p2a-c1-aflⅱ片段和tbev的感染性克隆用snabi和aflⅱ双酶切，将酶切片段跑胶回收，再用t4连接酶进行连接。构建含有nluc荧光素酶的tbev报告病毒tbevnluc2a。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过将构建的含有nluc荧光素酶的tbevnluc2a质粒转染至bhk21细胞，进行荧光素酶活性检测，验证了本发明tbevnluc2a的可用性。

2、本发明获得的tbevnluc2a质粒转染后可以用于检测蜱传脑炎病毒的复制情况。

3、本发明构建了含有nluc荧光素酶的tbev报告病毒，为进一步研究tbev的抗病毒药物的筛选奠定了基础。

附图说明

图1是本发明tbevnluc2a的构建图。

图2是检测tbevnluc2a质粒的荧光素酶情况；

具体实施方式

实施例1

(一)稳定表达含有nluc荧光素酶的蜱传脑炎病毒的报告病毒的构建方法

构建方法如图1所示。

蜱传脑炎病毒tbev感染性克隆，采用本实验室保存的tbevfl。

1、snabi-c38片段的克隆

以tbev感染性克隆为模板，引物1和引物2为特异性引物，pcr扩增蜱传脑炎病毒snabi-c38片段。

引物1：5’-tacgtattagtcatcgctattac-3’；

引物2：5’-gtgtgaagaccatcacgagtccatttggc-3’；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min。

2、p2a序列和nluc基因的连接

通过两轮pcr扩增，将p2a序列和nluc基因进行连接，具体为：

将p2a序列设计在引物上，并分两轮pcr将p2a序列连接到nluc基因上。

第一轮pcr：以nluc-pgemt为模板，nluc-f和p2anlucr1为引物进行pcr，扩增好目的片段后，回收目的条带。

引物nluc-f：

5’-atggtcttcacactcgaag-3’；

引物p2anlucr1：

5’-cagcaggctgaagttagtagctccgcttcccgccagaatgcgttcgcac-3’；

第一轮pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。

第二轮pcr：以第一轮pcr回收的目的条带为模板，nluc-f和p2anlucr2为引物进行pcr，扩增好目的片段后，回收目的条带。

引物nluc-f：

5’-atggtcttcacactcgaag-3’；

引物p2anlucr2：

5’-aggtccagggttctcctccacgtctccagcctgcttcagcaggctgaagttag-3’；

第二轮pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。

将第二轮pcr回收的目的条带连接到pgemt载体上，命名为nluc2apgemt。

3、构建nluc-p2a片段

以nluc2apgemt为模板，引物3和引物4为特异性引物，扩增出片段nluc-p2a，此时该片段与前后两部分有重叠序列。

引物3：5’-caaatggactcgtgatggtcttcacactcgaag-3’；

引物4：5’-cttcccggccataggtccagggttctcctc-3’；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min。

4、c1-aflⅱ片段的克隆

以tbevfl为模板，引物5和引物6为特异性引物，扩增出片段c1-aflⅱ。

引物5：5’-gaaccctggacctatggccgggaaggccattc-3’；

引物6：5’-cttaagcaacactccagtctgg-3’；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃2min30s为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。

5、构建snabi-c38-nluc-p2a-c1-aflⅱ片段

以引物1和引物6为特异性引物，步骤1)获得的snabi-c38片段、步骤3)获得的nluc-p2a片段和步骤4)获得的c1-aflⅱ片段为模板，通过重叠延伸pcr，将此三个片段连接在一起，得到snabi-c38-nluc-p2a-c1-aflⅱ片段；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃3min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。

6、含有nluc荧光素酶的tbev报告病毒的构建

将步骤5)获得的snabi-c38-nluc-p2a-c1-aflⅱ和tbev的感染性克隆用snabi和aflⅱ双酶切3h，将酶切片段跑胶回收，再用t4连接酶进行连接。构建含有nluc荧光素酶的tbev报告病毒tbevnluc2a。

(二)验证

以tbev感染性克隆为模板，成功构建出tbevnluc2a报告病毒。在c蛋白的第38个氨基酸后面插入nluc报告基因，tbevnluc2a报告病毒在nluc报告基因后面插入了2a序列。2a序列是为了方便nluc基因和其后的c蛋白的切割。构建好的报告病毒测序，测得的dna序列如seqidno.1所示，整个基因组均无突变。

(三)含有nluc荧光素酶的蜱传脑炎病毒tbevnluc2a的应用

1、转染细胞获得病毒

将bhk21细胞接种至细胞培养小皿，放入37℃培养箱培养过夜。待细胞密度达到80％，利用lip3000进行感染性克隆的转染操作。转染前将细胞培养基换成含有2％fbs的dmem(含双抗)。取2个1.5mlep管，分别加入125μlopti-mem培养基，标记管a和管b。管a加入7.5μllip3000，轻轻混匀；管b依次加入tbevnluc2a质粒2.5μg和lip30005μl，轻轻混匀。将管b中混合物逐滴加入管a，边加边混匀，室温孵育5min。将混合液逐滴滴入bhk-21细胞。转染后每天观察细胞的病变效应，第3-4天收取上清病毒悬液。

2、感染细胞扩增病毒

接种bhk21细胞至细胞培养小皿，放入37℃培养箱培养过夜。待细胞密度达到50％，进行感染实验。感染前配制好病毒稀释液。感染时首先吸出培养基并用d-hanks洗两次细胞。每个小皿加500ul病毒稀释液，并用封口膜包好，孵育1.5h，期间每隔30min震荡一次细胞。1.5h后补加1mld+2％fbs培养基。放置37℃，5％co2培养箱，扩增病毒3、nluc荧光素酶活性检测

接种bhk细胞至24孔板，培养过夜，接种tbevnluc2a报告病毒，放回37℃培养箱继续培养，在相应的时间点，利用报告基因检测系统检测各孔的nluc荧光素酶活性。配制新鲜细胞裂解液，弃去细胞上清，pbs洗1次，弃去pbs，每孔加入裂解液200μl，震荡裂解20min，按照1：50的比例将luciferaseassayreagent稀释于luciferaseassaybuffer中，取10μl待测裂解样品加入50μl稀释的luciferaseassayreagent，混匀，利用荧光素酶检测系统读取样品中nluc萤光素酶信号。每个样品在实验中均设置3个平行重复，结果如图2所示。

如图2所示，与阴性对照组相比，tbevnluc2a报告病毒的荧光素酶活性均有极显著差异。说明在报告病毒中nluc报告基因已经成功表达。

<110>辽宁大学

<120>蜱传脑炎病毒报告病毒tbevnluc2a的构建方法及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>14831

<212>dna

<213>tbevnluc2a

<400>1

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