一种新来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因及其应用方法

本发明涉及一种新来源的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因及其应用方法，属基因工程和酶工程技术领域。

背景技术：

稀有糖(raresugar)是自然界中天然存在但含量极少的一类单糖及其衍生物，其味类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜昧协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，可以弥补传统甜味剂的不足，对改善特殊人群的饮食起到重要作用，近年来受到人们的广泛关注。目前，所被报道的稀有糖已有50余种，其中d-阿洛酮糖(是果糖的c-3位差向异构体)作为一种典型代表，除具有低热量特点，还在抑制血糖升高与体脂积累、清除自由基、神经保护、修饰药物或活性物质从而优化其功能活性等诸多方面发挥着重要生理活性作用，是糖尿病及肥胖症人群的新型甜味剂，现已被应用于食品、保健、医药等各个领域。

但由于d-阿洛酮糖在自然界中的产量较少，难于提纯获得，因此目前主要通过化学合成法和生物催化法实现d-阿洛酮糖的生产。化学合成法包括利用钼酸离子催化d-果糖转化合成，利用1,2,4,5-二-o-异亚丙基-β-d-吡喃果糖合成，或通过加热乙醇和三乙胺合成等方式。但上述的化学合成法都存在纯化过程复杂、转化率低下、存在化学废弃物污染、伴有副产物生成等多种弊端，且化学合成成本较为昂贵，不利于d-阿洛酮糖的大规模生产。因此，利用生物转化技术合成功能性d-阿洛酮糖已成为国际上的研究热点。

d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(d-psicose3-epimerase，简称dpease，ec5.1.3.30)是一种典型的己酮糖-3-差向异构酶，是由韩国的kim教授于2005年在agrobacteriumtumefacien中最先发现的，随后，越来越多不同微生物来源的dpease被逐渐发现并在异源宿主中进行了克隆表达。因其与底物d-阿洛酮糖的亲和性更高，可单一催化d-果糖生成d-阿洛酮糖，故而成为生物转化法合成d-阿洛酮糖最常用的一种酶。目前，对dpease酶的研究主要集中于发现构建表达和对其酶学性质及晶体结构的探索，且以重组大肠杆菌表达系统的研究居多，利用dpease酶在食品工业中生产d-阿洛酮糖的研究却少有报道。由于以大肠杆菌为宿主克隆表达的dpease酶在工业应用上始终存在安全性问题，为促进dpease酶在食品工业中的应用，进一步扩大d-阿洛酮糖的规模化生产，因此，有必要建立并优化更安全、高效的食品级枯草芽孢杆菌重组表达体系，以适应工业化生产的需求。

技术实现要素：

为了解决上述存在的技术问题，本发明通过将来源于clostridiabacteriumisolateinta.cyc.091contig-100_981中编码d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因导入基因工程菌中实现d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达。

本发明提供了一种可用于编码酶活和热稳定性提高的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了含有所述基因的重组质粒，可在携带并表达所述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因。

在一种实施方式中，所述质粒为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pht01。

本发明还提供表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞是枯草芽孢杆菌。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌以bacillussubtiliswb600为宿主。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌构建方法为：利用双酶切构建的方法，将核苷酸序列为seqidno.1所示的d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因拼接到表达载体pht01上，构建重组质粒pht01/dpe，并将其转化至bacillussubtiliswb600中。

本发明还提供一种生产d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，是将所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产d-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

在一种实施方式中，所述发酵是将所述枯草芽孢杆菌在tb培养基中，于25～37℃发酵20～60h。

在一种实施方式中，所述发酵是将一定量的重组枯草芽孢杆菌接入含有氨苄青霉素的lb培养基，于37℃，200r/min培养至对数生长期，将培养好的种子培养液按4％(v/v)的接种量接种至含有氨苄青霉素的tb培养基，在25～37℃摇床中发酵培养20～60h，生产重组d-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

本发明还提供所述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因，或表达所述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌在生产功能性d-阿洛酮糖中的应用，所述应用是以d-阿洛酮糖-3-差向异构酶或含该酶的酶制剂为催化剂，以d-果糖为底物，促进d-果糖转化生成d-阿洛酮糖这一功能性稀有糖，所得的功能性d-阿洛酮糖可直接用于食品、药品等生产。

在一种实施方式中，所述酶制剂是基因工程菌发酵生产得到的粗酶液或经分离纯化后得到的纯酶以酶制剂的形式添加到底物中的。

本发明的有益效果在于：

1)实现了艰难梭状芽胞杆菌来源d-阿洛酮糖-3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的异源表达，方法安全、高效，可应用于食品、药品的生产中，所表达的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶粗酶液的催化活力可达到188.4u/mg；

2)本发明的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶与其它所报道的同类酶相比，优势在于其是一种新来源的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶，该来源在此前尚未报道过，且该来源的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶比酶活与热稳定性均高于现有报道的大多数d-阿洛酮糖-3-差向异构酶，且底物转化率也较好。

3)本发明的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的底物转化率和产物纯度较高，可以有效提高d-阿洛酮糖的产率，降低其工业生产成本，从而更具有工业应用价值。

附图说明

图1d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组质粒的构建流程

图2纯化重组d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的sds-page分析。

图3应用重组d-阿洛酮糖-3-差向异构酶制备产物时的hplc分析。

具体实施方式

d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶活测定方法如下：将200μl酶液加入到800μl含有果糖的tris-hcl缓冲液(50mm，ph7.5，0.1mmco²⁺)中，使得果糖终浓度为80g/l，反应总体积为1ml。振荡混匀后置于55℃水浴锅中反应10min，随后转移至沸水中灭酶10min，以终止反应；其中，用等量的tris-hcl缓冲液替换酶液，作为空白对照。待灭酶处理后，将反应液在10000rpm条件下离心10min，取上清液过0.22μm的水系膜去除杂质后，即可用高效液相色谱分析反应液中d-果糖和d-阿洛酮糖的浓度。

酶活单位定义：在标准酶反应条件下，单位时间内酶催化d-果糖生成1μmol的d-阿洛酮糖所需要的酶量为一个酶活单位。

实施例1枯草芽孢杆菌分泌表达系统的构建

根据d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因设计相应的扩增引物：

上游引物：5’-tacataggatccatgaaacacggaatctactacgcctattgggaaaagcaat-3’；

下游引物：5’-cacgcctctagattaatccagcatgtagcgctggaatgtgacagcgtttttggcgtcgaggtcg-3’。

利用上述引物以含clostridiabacteriumisolateinta.cyc.091contig-100_981dpease基因的合成质粒为模板，克隆出两端分别含bamhi和xbai限制性酶切位点的目的基因seqidno.1。

d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因的pcr体系为：taqbuffer(mg²⁺plus)10μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，模板dna1μl，taqdnapolymerase(1.25u/μl)1μl，加入双蒸水至50μl。pcr扩增条件为：98℃预变性3min；再进行30个循环(98℃10s，60℃15s，68℃2min)；最后68℃保温10min。

将pcr扩增出的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因插入到pmd18-tsimple质粒中得到克隆载体pmd18-tsimple/dpe，载体经双酶切后回收含有粘性末端的目的基因片段，并插入到经相同内切酶处理过的pht01质粒中，得到表达载体pht01/dpe。之后转化至大肠杆菌e.colijm109中，涂布具有氨苄青霉素的lb平板，挑取转化子进行测序、菌落pcr验证，提取得到含有d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因的重组质粒。将重组质粒转化至b.subtiliswb600中，得到重组基因工程菌。

实施例2重组d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的发酵生产

从保藏平板挑取含重组质粒的枯草芽孢杆菌单菌落接种于50ml含有氨苄青霉素的lb培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，ph7.0)中，37℃、200rpm下摇瓶培养过夜；按4％的接种量转接至50ml、含有氨苄青霉素的tb培养基(1.2％胰蛋白胨，2.4％酵母提取物，0.4％甘油，17mmkh2po4，72mmk2hpo4，ph6.0)中，25～37℃、200rpm下摇瓶培养20～60h；将30ml、od为6的发酵液在4℃、10000rpm下离心10min，丢弃上清液，用50mm、ph7.5的tris-hcl洗涤菌体沉淀表面3次，再采用bindingbuffer(50mmtris-hcl,500mmnacl,ph7.5)重悬菌体，随后加入1mg/ml的溶菌酶，37℃水浴保温30min，在200w、开1s、关2s程序下，置于冰上超声破碎15min，最后在4℃、10000rpm条件下离心20min，取上清液，即为胞内酶液，其粗酶活为102.12u/ml。

按上述相同方法将产重组d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌在tb培养基中，于30℃发酵不同时间后，取酶液测定其活力及蛋白浓度，计算得到比酶活为188.4u/mg。

实施例3重组d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的分离纯化

发酵粗酶液采用0.45μm水系膜进行过膜处理后，用5个柱体积的a液(500mmnacl,50mmtris-hcl,ph7.5)平衡镍柱；上样，流速为1ml/min，再用a液重新平衡后，先用含低浓度咪唑的洗脱液1(500mmnacl,50mmtris-hcl,20mm咪唑,ph7.5)洗去部分杂蛋白，随后用60％的洗脱液2(500mmnacl,50mmtris-hcl,500mm咪唑,ph7.5)洗下目的蛋白，根据洗脱峰收集对应洗脱液，置于透析袋中，在4℃条件下采用50mm、ph7.5的tris-hcl进行过夜透析，随后通过sds-page蛋白电泳(图2)及酶活测定的方式进行鉴定。据报道，重组d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的计算分子量为32.3kda，与sds-page估算分子量相符。

实施例4重组d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的应用生产

利用重组d-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行d-阿洛酮糖的生产制备，其反应过程如下：首先将含有80g/l果糖的底物溶液(50mmtris-hcl，ph7.5，0.1mmco²⁺)置于55℃水浴摇床中预热10min，随后加入10u/g酶液，在55℃水浴摇床中反应2h，随后转移至沸水中灭酶20min，以终止反应；其中，用等量的tris-hcl缓冲液替换酶液，作为空白对照。待灭酶处理后，将反应液在10000rpm条件下离心10min，取上清液过0.22μm的水系膜去除杂质后，即可用高效液相色谱分析反应液中d-果糖和d-阿洛酮糖的浓度。色谱分析结果如图3所示，计算得到转化率可达31％。

对比例：

具体实施方式同实施例1～4，区别在于，将clostridiabacteriumisolateinta.cyc.091contig-100_981来源的基因替换现有报道的其他来源d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因，按照实施例1～4相同的策略方法构建重组基因工程菌，相同条件下培养并得到酶液，对其活力及酶学性质进行测定后，对比结果如表1所示，由表中的数据可知，seqidno.1所示基因编码的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶在活力及热稳定性方面均优于现有报道的大多数d-阿洛酮糖-3-差向异构酶，且转化率也处于较高水平，因此具有十分广阔的应用潜力。

表1不同来源的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>江南大学

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