一种只包含Cu的SOD基因及编码的蛋白质和其应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种只包含cu的sod基因及编码的蛋白质和其应用。

背景技术：

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)是一种广泛存在于生物体内的金属蛋白酶，它能够清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基(·o^2-)，是生物体有效清除活性氧的重要抗氧化酶类之一，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线。研究发现，sod在人体的衰老和死亡中发挥着重要作用，有很多疾病的发生与发展均与sod密切相关，补充sod可以达到预防和治疗各种疾病、延缓衰老的目的。sod在多种环境胁迫中发挥着重要的生物学功能，如抵抗重金属、化学污染物、温度、水分、盐分、辐射等产生的氧化胁迫。sod被广泛地应用于食品、化妆品、日用品、疾病治疗等多方面，因此，sod在生物抗氧化中的作用越来越受到重视。

sod根据与其结合且发挥作用的金属离子的种类，可分为cuznsod、mnsod、fesod和nisod四大类。cuznsod由两个相同的亚基组成，亚基之间通过非共价的疏水作用来相互缔合，肽链内部形成的分子内二硫键对亚基缔合起着重要的作用。每个亚基活性中心包括一个cu原子和一个zn原子，cu参与电子传递，它的存在是cuznsod活性所必须的，而zn与保持酶活性中心构象相关，不直接与超氧阴离子自由基作用，起到稳定活性中心周围环境的作用。

近年来，越来越多的cuznsod基因及其编码的蛋白质被发现，但是，只包含cu的sod基因较少。本发明在中华稻蝗中发现了一种只包含cu的sod基因及其蛋白质。该蛋白是否仍具有清除自由基的功能，本发明运用基因工程技术体外表达并分离纯化该蛋白质，对其功能进行了研究，发现该蛋白具有抗氧化功能。

技术实现要素：

针对上述问题本发明提供了一种只包含cu的sod基因及编码的蛋白质和其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

本发明提供的只包含cu的sod基因来源于中华稻蝗，其名称为cu-onlysod，所述cu-onlysod的基因序列如seqidno:1所示。该基因序列以中华稻蝗cdna为模板，通过简并引物获得部分片段，接着通过race-pcr方法获得全长，最后利用特异引物进行pcr扩增、克隆测序验证全长序列。

一种由上述cu-onlysod基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno：2所示，该蛋白质为超氧化物歧化酶，具有抗氧化的功能。

一种含有上述cu-onlysod基因的载体，所述载体为原核细胞表达载体。

进一步，所述原核细胞表达载体为pcoldi表达载体。

一种含有上述cu-onlysod基因的基因工程细胞，所述基因工程细胞为大肠杆菌细胞。

一种上述cu-onlysod基因编码的蛋白质的应用，应用在制备自由基清除的产品。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

cuznsod由两个相同的亚基组成，每个亚基活性中心包括一个cu原子和一个zn原子。本发明在中华稻蝗体内发现一种只包含cu的sod基因及其蛋白质，该蛋白缺少zn原子，只包含一个cu原子。功能研究发现该蛋白具有抗氧化活性。此蛋白为细胞内cu-onlysod，未在任何物种中报道过只包含cu的细胞内sod。

本发明只包含cu的sod具有抗氧化功能及sod特性，能够被应用到医药、食品、化妆品、保健品等行业，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1为实施例1中cu-onlysod基因引物设计；

图2为实施例1中cu-onlysod基因全长验证的pcr产物凝胶电泳图；

图3为实施例1中cu-onlysod基因翻译后氨基酸序列的一级结构示意图；

图4为实施例2中cu-onlysod蛋白空间结构模拟图；

图5为实施例5中cu-onlysod蛋白的功能验证图。

具体实施方式

实施例1：中华稻蝗cu-onlysod基因序列获得

1、中华稻蝗cu-onlysod基因保守区序列获得

根据已公布的其它昆虫物种的cuznsod基因序列设计简并引物，位置、长度如图1所示，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，其引物的序列如下所示：

上游引物序列如seqidno：3所示：

ttycaygtncaygarttygg；

下游引物序列如seqidno：4所示：

ckngcnccngcrttncc；

选取活力良好、大小均匀的中华稻蝗5龄若虫雌雄虫各5头(田间采集4龄若虫实验室内饲养到5龄若虫)，迅速于液氮中冷冻，于-80℃中低温保存。根据trizol试剂盒(takara公司)说明书的方法提取中华稻蝗整虫的总rna。采用m-mlv反转录酶(takara公司)将总rna反转录成cdna。以此为模板，利用已合成的简并引物(图1)，通过pcr扩增仪进行pcr扩增，并连接、转化、测序，获得cu-onlysod基因的保守区序列片段。

2、中华稻蝗cu-onlysod基因5’和3’序列获得

根据已获得的保守区片段设计3’和5’race特异引物(图1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，其引物序列如下所示：

上游引物序列如seqidno：5所示：

agaccacaacgtcattggccgcac；

下游引物序列如seqidno：6所示：

ttcccaggtcgtcagggtca；

根据mrnaisolationsystems试剂盒(promega公司)说明书分离mrna。根据smarttmracecdnaamplificationkit(promega公司)说明书合成5’和3’-race-readycdna。按照2polymerase(promega公司)说明书的扩增反应体系和反应条件进行cu-onlysod基因5’和3’末端cdna序列的扩增，并连接、转化、测序，获得cu-onlysod基因的5’和3’端序列。

3、中华稻蝗cu-onlysod基因全长序列验证

对已获得的cu-onlysod基因的保守区序列、5’和3’端序列进行拼接，然后设计验证全长序列的特异引物，其序列如下所示：

上游引物序列如seqidno：7所示：

ttatatttcagacatgactatyaaagcag；

下游引物序列如seqidno：8所示：

cgccttcatgccttggcaatgccgatca；

通过pcr扩增仪进行pcr扩增，凝胶电泳检测(图2)，然后连接、转化、测序，验证cu-onlysod基因的全长序列，其序列为seqidno:1。利用expasy-translatetool(https://www.expasy.org/translate)将中华稻蝗cu-onlysod基因序列翻译成氨基酸序列，其序列为seqidno:2，该基因编码131个氨基酸。cu-onlysod蛋白的特征序列和n-糖基化位点分别利用prosite数据库(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)和netnglyc1.0server(http://www.cbs.dtu.dk/services/netnglyc/)预测，该蛋白包含2个特征序列，4个cu结合位点，2个zn结合位点，无糖基化位点(图3)。

实施例2：中华稻蝗cu-onlysod蛋白的空间结构模拟

利用swiss-model软件(http://www.swissmodel.expasy.org/)和家蚕cuznsod蛋白(pdbids：319y.1.a)为模板，对中华稻蝗cu-onlysod蛋白的空间结构进行模拟。空间结构显示，该蛋白中不包括zn原子，只包含一个cu原子，包含6个反向平行的β折叠和2个α螺旋(图4)。

实验例3：中华稻蝗cu-onlysod蛋白重组表达载体的构建

根据已验证的全长序列设计上游带bamhi和下游带hindiii酶切位点的蛋白表达引物，从已测序确证全长序列的菌液中提取质粒。以质粒为模板，带酶切位点的蛋白表达引物进行pcr扩增，扩增产物经电泳检测后，切胶进行胶回收，将回收产物连接到peasy-t3载体上(全氏金公司)，转化入大肠杆菌感受态细胞trans-t1(全氏金公司)中，并涂布于含有100mmiptg、20ng/mlx-gal和100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基平板上，37℃过夜培养，进行蓝白斑筛选。挑取白斑接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃过夜培养，由生工生物工程(上海)有限公司测序，确定序列的正确性。

从测序确证序列的菌液中提取质粒，用bamhi和hindiii内切酶(neb公司)酶切带目的基因的质粒及pcoldi蛋白表达载体，电泳检测酶切产物，切胶并进行胶回收。用t4连接酶(全氏金公司)将经酶切的目的基因和蛋白表达载体进行连接，构建重组质粒，然后转化入大肠杆菌感受态细胞trans-t1(全氏金公司)中，并涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基平板上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃过夜培养，由生工生物工程(上海)有限公司测序，确定序列的正确性。

从测序确证序列的菌液中提取重组质粒，将重组质粒转化入感受态细胞bl21(de3)(全氏金公司)中，并涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基平板上，37℃过夜培养，挑取阳性克隆接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃过夜培养。

实施例4：中华稻蝗cu-onlysod蛋白的原核表达及纯化

1、中华稻蝗cu-onlysod蛋白的原核表达及鉴定

取50μl已将目的基因重组质粒转入到bl21(de3)感受态细胞的菌液于5ml新鲜的含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃培养至菌液od600为0.6时，加入终浓度为0.4mm的iptg，在16℃、200rpm条件下进行低温诱导，经14h诱导目的蛋白的表达。

在低温冷冻离心机中离心收集已诱导的菌体，加入含有0.1mnacl和5％甘油的20mmtris-hcl(ph8.0)裂解液，在冰上对菌体进行超声破碎，在4℃、12000g离心10min，收集上清。制备5％浓缩胶和12％分离胶的聚丙烯酰胺凝胶，将收集的上清液95℃变性，上样，电泳，拍照，对凝胶上的电泳条带进行鉴定后为cu-onlysod蛋白。

2、中华稻蝗cu-onlysod蛋白的分离纯化

按照实施例4第1步中的方法诱导500ml菌液，离心收集菌体，冰上超声破碎，低温离心收集上清。将上清液用20mlni²⁺柱纯化，100mm咪唑洗脱，收集洗脱液。洗脱液用2mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液4℃过夜透析，再用超滤离心管低温浓缩，得到纯化后的蛋白。蛋白含量为2.0mg/ml，活性为25.2u/mg蛋白。

实施例5：中华稻蝗cu-onlysod蛋白的功能验证

制备不含抗生素的lb固体培养基平板。将平板于37℃预热30min，取150μl实施例4第2步中纯化的蛋白滴加于平板上，对照平板中滴入等体积的2mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液，均匀涂布，置于37℃培养箱中30min，让液体充分吸收。设置3个生物学重复。然后取100μl大肠杆菌滴于平板上，涂布均匀，置于37℃培养箱中培养1h。最后在平板中放入两块直径6mm已灭菌的滤纸，在滤纸上分别滴加8μl5％和15％的过氧化氢溶液，先将平板正置于37℃培养箱中培养1h，然后将平板倒置过夜培养。用扫描仪扫描平板，用直尺量取抑菌圈的直径，进行统计学分析(图5)。结果显示在15％过氧化氢的胁迫下，加入纯化的cu-onlysod蛋白的抑菌圈直径显著小于对照组，表明该cu-onlysod蛋白具有抗氧化功能。

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序列表

<110>山西大学

<120>一种只包含cu的sod基因及编码的蛋白质和其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>396

<212>dna

<213>中华稻蝗(oxyachinensis)

<400>1

atgactattaaagcagtttgcgtgctgaacggtgaacaggtgaaaggaacagttcacttt60

gagcaagagggtgcgaattctcctgttaaagtaactggagaaataactggcttgacaaag120

ggtctgcatggtttccatgtacatgaatttggtgataacacaaacggctgcatgagtgcg180

ggtgcacatttcaacccacacagcaaggaccacgcaggccccgaggattcggacaagatt240

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gacgacctgggacgtggtggacacgagctgagcaagacgactggcaatgccggggcgcgc360

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<210>3

<211>131

<212>prt

<213>中华稻蝗(oxyachinensis)

<400>3

metthrilelysalavalcysvalleuasnglygluglnvallysgly

151015

thrvalhisphegluglngluglyalaasnserprovallysvalthr

202530

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505560

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65707580

ileserleuthrglyasphisasnvalileglyargthrleuvalval

859095

hisalaaspproaspaspleuglyargglyglyhisgluleuserlys

100105110

thrthrglyasnalaglyalaargvalalacysglyvalileglyile

115120125

alalysala

130

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ttycaygtncaygarttygg20

<210>4

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ckngcnccngcrttncc17

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

agaccacaacgtcattggccgcac24

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<213>人工序列(artificialsequence)

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ttcccaggtcgtcagggtca20

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<213>人工序列(artificialsequence)

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ttatatttcagacatgactatyaaagcag29

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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