VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及vaca重组蛋白的制备、复性和保存方法。

背景技术：

vaca毒素是hp最重要毒力因子之一，vaca蛋白在慢性胃炎-癌的发病机制中扮演着非常重要的角色。

目前缺乏统一的vaca毒素高效表达体系，使基于vaca结构和功能的基础研究受到阻碍。研究表明，从hp中提取的天然vaca产量少，工作量大且纯化困难；从hp分泌上清中收集的vaca毒素粗纯液成分复杂多样，难以解释分析蛋白功能；而传统的vaca重组蛋白多不具有活性，需在体外用hcl激活后才具有生物活性。因此，如何获得高产量且具有生物活性的vaca重组蛋白具有重要的科学意义。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明成功构建了vaca重组质粒，在大肠埃希菌内诱导表达重组蛋白,所述vaca重组蛋白在ph2.9的醋酸缓冲液进行复性和保存，且复性保存后的vaca重组蛋白具有促凋亡的生物活性。

基于上述发现，本发明的目的在于提供一种vaca重组蛋白的制备、复性和保存方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

获取vaca基因序列，经pcr扩增后构建vaca重组表达载体；

将所述表达载体转化到大肠埃希菌中，经扩增培养后加入诱导剂诱导蛋白表达，获得菌液；

将所述菌液离心后取细菌沉淀物，采用裂解缓冲液对所述细菌沉淀物超声裂解，获得细胞裂解物；将所述细胞裂解物纯化后获得vaca重组蛋白；

将所述vaca重组蛋白采用ph＝2.9的醋酸缓冲液进行透析、复性并保存。

进一步的，所述vaca基因序列pcr扩增的条件为：

引物序列为：

f1:5'caatcgttggcggcatcgctacgggtacggctgttggcacggtttcgggcctgcttagttggggactc3'；

f:5'ctttaagaaggagatatacatatgtttttcaccacggttatcattccggcaatcgttggcggcatcgct3'；

反应条件如下：96℃预变性5min；96℃30秒，57℃30秒，72℃1分20秒，72℃5分钟。

进一步的，将所述表达载体转化到大肠埃希菌中，经扩增培养后加入诱导剂诱导蛋白表达，获得菌液步骤，具体包括：

将表达载体转化到大肠埃希菌中，涂布k⁺平板，37℃培养过夜，再将单个菌落接种至含有卡那霉素的lb培养基培养过夜，转入含k⁺的lb培养基培养；

当细胞增殖生长曲线在600nm达到od＝1.2时，加入0.5mm异丙基硫代半乳糖苷诱导剂诱导蛋白表达，获得菌液。

进一步的，所述采用裂解缓冲液对所述细菌沉淀物超声裂解，获得细胞裂解物步骤具体包括：

采用裂解缓冲液三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液对所述细菌沉淀物在超声功率为500w，超声3s，间歇3s，超声15min，获得细胞裂解物。

进一步的，所述细菌裂解物经离心后获得第一上清液和包涵体沉淀。

进一步的，将所述细菌裂解物中的第一上清液进行纯化获得vaca重组蛋白具体包括：

采用ni-ida树脂，以裂解缓冲液为柱平衡缓冲液，并以含咪唑的裂解缓冲液进行梯度洗脱，获得vaca重组蛋白。

进一步的，将所述细菌裂解物中的包涵体沉淀进行纯化获得vaca重组蛋白具体包括：

将所述包涵体沉淀溶于变性缓冲液并超声裂解，经离心后获得第二上清液，将所述第二上清液采用ni柱，以变形缓冲液作为柱平衡缓冲液和洗涤缓冲液洗脱杂蛋白，并以含有咪唑的洗涤缓冲液进行洗脱，获得vaca重组蛋白。

进一步的，所述变性缓冲液为：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和尿素的复配溶液；所述洗涤缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、尿素、聚氧乙烯单叔辛基苯基醚和氯化钠复配溶液。

有益效果：

本发明通过扩增vaca毒素基因片段，并构建了重组质粒，将其转化至大肠埃希菌中，获得稳定表达的阳性工程菌，以iptg诱导工程菌高效表达重组蛋白vaca,分别从上清液及包涵体纯化目的蛋白，通过不同缓冲液复性蛋白，发现vaca重组蛋白可以通过ph2.9的醋酸缓冲液复性并保存，该保存于醋酸缓冲液中的vaca重组蛋白与ges-1细胞孵育，通过倒置显微镜、透射电镜及tunel法检测细胞凋亡，发现细胞体积减小，出现了早期核着边固缩、染色质边集等凋亡改变，vaca重组蛋白能够诱导细胞凋亡，具有生物活性。

本发明首次提出了采用ph＝2.9的醋酸缓冲液作为vaca重组蛋白的复性保存缓冲液，一方面能够保证vaca重组蛋白的活性，另一方面保存条件温和，对操作人员无任何不良作用，且原料易得，成本低，环境友好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的vaca重组质粒构建；a)为vaca表达载体pet41b-vaca^34-854构建示意图；b)为pet41b-vaca^34-854酶切鉴定结果；c)为重组质粒pet41b-vaca^34-854的阳性克隆测序图；

图2为本发明实施例提供的vaca重组蛋白表达与纯化过程的sds-page和westernblot分析图；a、b)：分别通过sds-page和westernblot分析vaca蛋白在大肠埃希菌中的表达；c、d)分别通过sds-page和westernblot分析用ni柱纯化上清液中的vaca蛋白；e)通过sds-page分析用ni柱纯化包涵体的vaca蛋白；

图3为本发明实施例提供的vaca重组蛋白的表达鉴定sds-page分析和westernblot分析图；ab、cd分别为从第一上清液、包涵体纯化vaca重组蛋白后鉴定：sds-page分析(左)和westernblot分析(右)；

图4为本发明实施例提供的sds-page及westernblot检测不同复性buffer复性后的蛋白量；

图5为本发明实施例提供的vaca重组蛋白(65ug/ml)刺激ges-1细胞于倒置显微镜下观察图；

图6为本发明实施例提供的透射电镜观察ges-1细胞显微结构改变图；

图7为本发明实施例提供的tunel法检测由vaca重组蛋白诱导的细胞凋亡，a)为实验组和对照组tunel测定的代表性图像，b)为实验组和对照组的量化凋亡率对比图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

在本发明实施例中，所采用的细胞株和菌株为：ges-1细胞、h.pylori标准株(菌株j99/atcc700824)由中南大学肿瘤研究所提供，大肠埃希菌top10、bl21(de3)、质粒pet41b购自南京金斯瑞有限公司。

在本发明实施例中，dna抽提试剂盒购自中国takara公司，质粒抽提试剂盒购自购自美国invitrogen公司，page-masterproteinstandard(forsds-page)、easywesternproteinstandard、thetmhistagantibody均购自中国南京金斯瑞有限公司(货号分别为m00516，mm0908，a00186)。其他试剂由中南大学肿瘤所提供。

实施例1

构建vaca重组表达载体

以h.pylori标准株(菌株j99/atcc700824)的vcaa基因序列(vaca毒素成熟片段，表达第34-854位氨基酸的序列)为模板合成突变引物，基因两端引物，引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。序列seqidno.1中包含限制性内切酶ndei的识别位点，序列seqidno.2中包含限制性内切酶xhoi的识别位点。在反应条件为：96℃预变性5min；96℃30秒，57℃30秒，72℃1分20秒，72℃5分钟(设25个循环)的条件下进行pcr扩增。

将pcr产物经限制性内切酶ndei和xhoi酶切后，插入含c端组氨酸标签(8his标签)的表达载体质粒pet41b(novagen公司)；将pcr产物和pet41b质粒以10：1结合在1×连接缓冲液(50mmtris-hcl,ph7.5,10mmmgcl2,1mmatp,1mmdl-dithiothreitol(dtt)，25％(w/v)polyethyleneglycol8000)中，加入t4dna连接酶至20μl的终体积，并在16℃孵育过夜。取10ul连接产物与100ul大肠埃希菌top10感受态细胞((100μl,1×108cfu/μg，细胞在600nm处的光密度达到0.5～0.8))混匀后冰浴30min，42℃热激60s，立即冰浴2min，加入预热至室温的800ullb培养液，37℃恒温摇床培养1.5h，取培养后的菌液12000r/min离心2min，弃去800ul培养上清，余下液体重悬沉淀，均匀涂布于含k⁺抗性的lb培养皿上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。挑取5个生长良好的菌落接种于含5ulk⁺的5mllb培养基中，37℃恒温摇床培养过夜获得重组质粒，即vaca重组表达载体。

根据质粒抽提试剂盒说明书抽提质粒，ndei/xhoi双酶切后1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，可酶切到2502bp阳性克隆。将鉴定正确的重组克隆进行测序验证。如图1a所示的vaca重组质粒构建示意图，以重组质粒为模板的实验组可见大小约为2502bp的单一特片性条带，与预期片断基本一致，重组质粒经ndel+xhol双酶切鉴定，得到相应的两条电泳带，与预期空质粒和目的基因片段大小相符(图1b)，代表重组质粒酶切鉴定为阳性。质粒的测序结果与genebank中的vaca成熟片段对应序列完全一致(图1c)，证明是特异性的目的基因pcr产物，重组质粒构建成功。

实施例2

vaca重组蛋白的表达和纯化

将重组后的质粒转化到大肠埃希菌bl21(de3)中，涂布k⁺平板，37℃培养过夜。随后将单个菌落接种到含卡那霉素(50μg/ml)的50mllb培养基中，菌落于37℃、200rpm的摇床里培养过夜。取100ul转入含k⁺的5mllb中培养，于37℃、200rpm继续培养，观察细胞生长密度，当细胞增殖生长曲线在600nm达到od＝1.2时，加入0.5mmiptg，在不同条件下(20℃诱导20h、37℃诱导4h、15℃诱导16h)以200rpm的转数诱导蛋白表达。诱导结束后使菌体重悬，通过sds-page及westernblot鉴定表达情况。

收集上述培养获得的菌液，离心后弃上清，用裂解缓冲液(50mmtris-hcl，ph8.0)重悬细胞沉淀，超声裂解细胞(500w，超声3s，间歇3s，共15min)，以13,000rpm，离心30min于4℃收集细胞裂解物。其中细胞裂解物包括第一上清液和包涵体。

从第一上清液纯化vaca重组蛋白具体包括：用ni-ida树脂从上清液中纯化目标蛋白。以上述裂解缓冲液(tris-hcl50mmol,nacl150mmol,ph8.0)为柱平衡缓冲液，目标蛋白用咪唑缓冲液(tris-hcl50mmol,nacl150mmol,ph8.0+咪唑梯度浓度分别为20、50、100、500mmol)梯度洗脱，然后用洗涤液(tris-hcl50mmol,nacl150mmol，1％tritonx-114,ph8.0)洗涤，采用western-blot和sds-page进行分析。根据western-blot和sds-page结果，将目标蛋白表达量最多的条带汇集并透析到ph7.4的1×pbs缓冲液中。在14kda透析膜中进行4小时透析，并将上述缓冲液替换为相同的新鲜缓冲液(1×pbs,ph7.4)，再进行16小时透析。透析后，样本在13000rpm的条件下离心30分钟，通过0.22μm过滤器过滤获得vaca重组蛋白。

从包涵体中纯化vaca重组蛋白具体包括：将包涵体沉淀溶于变性缓冲液(50mmtris-hcl,8murea,ph8.0)后超声裂解，细胞沉淀以13000rpm于4℃离心30min获得第二上清液，并将第二上清液用于进一步纯化。用ni柱(nta)纯化上清液中的靶蛋白。使用变性缓冲液作为柱平衡缓冲液(50mmtris-hcl,8murea,ph8.0)和用洗涤缓冲液(50mmtris-hcl，1％tritonx-114，8murea，150mmnacl，ph8.0)洗脱杂蛋白，然后用不同浓度咪唑的洗脱缓冲液(tris-hcl50mmol，nacl150mmol，ph8.0+不同浓度咪唑浓度如20、500mmol)洗脱目的蛋白，收集各组分洗脱液进行sds-page和westernblot分析，获得vaca重组蛋白。

以诱导条件为：15℃诱导过夜处理获得的菌液为例，采用上述方法进行重组蛋白的纯化，并通过sds-page和westernblot分析，其结果如图2、3所示，图2中a、b)：分别通过sds-page和westernblot分析vaca蛋白在大肠埃希菌中的表达：泳道m：蛋白质标记；泳道nc：无诱导的细胞裂解物；泳道1：在15℃诱导16小时的细胞裂解物；泳道2：在15℃诱导16小时的细胞裂解物的上清液；泳道3：在15℃诱导16小时的细胞裂解物的沉淀。c、d)分别通过sds-page和westernblot分析用ni柱纯化上清液中的vaca蛋白，泳道m：蛋白marker；泳道1：细胞裂解物离心后的上清液；第2道：流出；泳道3-5：用50mmtris-hcl，20mm咪唑，150mmnacl，ph8.0洗脱；泳道6-7：用50mmtris-hcl，50mm咪唑，150mmnacl，ph8.0洗脱；泳道8-9：用50mmtris-hcl，100mm咪唑，150mmnacl，ph8.0洗脱；泳道10-11：用50mmtris-hcl，500mm咪唑，150mmnacl，ph8.0洗脱。e)通过sds-page分析用ni柱纯化包涵体的vaca蛋白，泳道m：蛋白marker；第2道：流出；泳道3：细胞裂解物离心后的沉淀；泳道4：用50mmtris-hcl，20mm咪唑，8m尿素，ph8.0洗脱；泳道5：用50mmtris-hcl，300mm咪唑，8m尿素，ph8.0洗脱。图3中ab、cd分别为从上清、包涵体纯化vaca重组蛋白后鉴定：sds-page分析(左)和westernblot分析(右)；泳道1:bsa(2.00μg)；泳道2:vaca34-854(2.00μg)；泳道3:vaca34-854；m1、m2均为蛋白marker。由上述可知，采用本发明的分离纯化方法可以获得vaca重组蛋白，且相较于上清液纯化，从包涵体可以获得更多的重组蛋白。

实施例3

将从包涵体纯化获得的vaca重组蛋白进行复性，选取如表1所示的缓冲液。将重组蛋白采用如表1所示的缓冲液中进行复性，蛋白质的复性分析通过蛋白质的溶解度(当蛋白质溶解在缓冲液中，若出现沉淀物表明复性失败，若完全溶解则表明复性成功)，或者根据sds-page和western-blot分析结果(收集裂解液，进一步用sds-page和western-blot分析蛋白含量)。

表1复性缓冲溶液的选择

收集复性后的vaca重组蛋白，通过截留分子量为14kda的透析膜4小时后，更换新鲜的上述相同缓冲液透析16小时，最后透析至最终缓冲液中16小时。根据蛋白质复性结果以及在溶液中使用的缓冲溶剂选择最合适的蛋白最终保存液。最终保存液不得干扰目标蛋白的生物活性检测。透析结束后，靶蛋白以13000rpm离心30分钟，并通过0.22μm过滤器过滤。通过sds-page和westernblot鉴定蛋白复性效果。

如图4所示，其中泳道m：蛋白marker；泳道1：蛋白复性前；泳道2：50mmtris,10％gly，150mmnacl,ph8；泳道3：50mmtris,10％gly，150mmnacl,0.1mmdtt,ph8.0；泳道4：1×pbs,ph7.4；泳道5：1×pbs,10％gly,500mmnacl,ph7.4；泳道6：1×pbs,10％gly,500mmnacl,0.1mmdtt,ph7.4；泳道7：20mmtris,2murea,400mmarg,2.5mmcysteamine,0.25mmcystamine,ph8.5，泳道8：50mm醋酸，ph2.9。由4可知，在不同缓冲溶液中vaca重组蛋白复性效果不同，其中在缓冲液1-5中均没有复性成功，而在缓冲液6、7中复性成功后，再采用缓冲液6和缓冲液7作为最终缓冲液透析保存；缓冲液6中含有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、尿素、精氨酸、半胱胺和胱胺等多种物质，配置过程复杂，且该缓冲液中的精氨酸会干扰vaca重组蛋白的促凋亡生物活性，因此缓冲液6不适合用于vaca重组蛋白的最终保存液；缓冲液7为50mm醋酸，配置简单，含有的化合物仅为醋酸，原料来源广泛，成本低，且具有环保性，且能够成功复性和保存vaca重组蛋白。

将实施例4获得的重组蛋白以终浓度为65ug/ml的vaca重组蛋白刺激ges-1细胞(vaca组)，共同孵育24h，以等体积缓冲液(50mm醋酸，ph2.9)设为对照(buffer)，同时以标准培养基设空白对照(normalcontrol)。分别于孵育6h、12h、24h后于倒置显微镜下观察细胞形态变化，如图5所示；并采用透射电镜观察24h后空白对照组、缓冲液对照组以及不同放大程度的实验组的ges-1细胞纤维结构，如图6所示。由图5可知，vaca蛋白刺激组细胞凋亡明显，出现大量胞核固缩、核内染色质趋边凝聚的现象，但各时间点均未见明显细胞空泡化。由图6可知，缓冲液对照组和空白对照组未出现异常，而在vaca重组蛋白组，其中c1：细胞体积减小，表面微绒毛消失(放大倍数×5000)；c2：核向周边皱缩凝集(放大倍数×10000)；c3和c4：细胞质崩解，出现大量液泡(放大倍数×10000)。另外，采用tunel法检测由vaca重组蛋白诱导的细胞凋亡，细胞核采用dapi(蓝色)复染，tunel阳性细胞(红色)代表细胞凋亡，其结果如图7所示。说明采用醋酸透析保存的vaca重组蛋白具有促凋亡活性。

本发明通过扩增vaca毒素基因片段，并构建了重组质粒，将其转化至大肠埃希菌中，获得稳定表达的阳性工程菌，以iptg诱导工程菌高效表达重组蛋白vaca，分别从上清液及包涵体纯化目的蛋白，采用复性缓冲液(ph2.9醋酸缓冲液)进行复性处理，获得复性蛋白，并采用ph2.9醋酸缓冲液透析保存，并对保存后的vaca重组蛋白进行生物活性测试，该vaca蛋白具有促凋亡活性。因此，ph2.9醋酸缓冲液可以作为重组vaca重组蛋白的复性及保存溶液，其一方面能保证vaca重组蛋白的活性，另一方面该保存条件温和，对操作人员无任何不良作用，且原料易得，成本低，环境友好。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。