本发明属于食品加工技术领域，更具体地，涉及一种多菌种复合发酵蜂蜜醋的方法。
背景技术：
蜂蜜醋是以蜂蜜为原料，经过微生物发酵而形成。经过微生物的转化，不仅保留了蜂蜜的营养价值，还增加了丰富的有机酸，氨基酸等代谢物，营养和口感都变得更加丰富。蜂蜜醋的有机酸主要成分是乙酸，苹果酸，乳酸，琥珀酸、柠檬酸等，经常饮用可以促进人体新陈代谢，提高细胞抗氧化功效，具有降血糖，降血脂，抗疲劳，抗氧化、增加新陈代谢、减脂等多种保健效果。此外，其氨基酸含量丰富，包含8种人体必须氨基酸，营养价值高，也是醋的重要呈味物质。目前，国内外对蜂蜜醋的研究不多，醋酸的工业发酵，以酒精转化醋酸的菌种为主。
微生物发酵蜂蜜醋是一个复杂的代谢过程，菌株在生长代谢过程中产生的物质直接影响着蜂蜜醋的风味品质。蜂蜜醋的发酵过程中存在多种不同代谢途径，如糖酵解途径，单糖分解成丙酮酸，在厌氧条件下转化为乙醇，在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶作用下生成乙酸；葡萄糖生成葡萄糖酸；三羧酸循环的柠檬酸、琥珀酸；其他的还有丁酸、氨基酸、乳酸等。而蜂蜜醋中非挥发酸的含量高低是影响蜂蜜醋口感和风味的关键因素，而要得到较高的非挥发酸含量，需要对蜂蜜醋酿造过程中原料选择、发酵菌种、发酵工艺等多方面进行有效的控制。
专利cn105062859b提供了一种蜂蜜醋的制备方法，是将酵母菌和醋酸菌在同一条件下进行一步法发酵使酒精发酵和醋酸发酵混合进行，缩短发酵周期，由该方法得到的蜂蜜醋总酸可以达到11.3～11.8g/l，总酯为2.87g/l左右，酒精度为2％(v/v)左右，还原糖达17g/100ml以上。但该方法采用酒精发酵与醋酸发酵同时进行，不便于工业生产中调控发酵方向，且该方法制备的蜂蜜醋中总酸含量不高，未考察其中非挥发酸的含量。
技术实现要素：
本发明针对现有蜂蜜醋发酵技术存在的不足，旨在提供一种多菌种复合发酵蜂蜜醋的方法，通过有效控制发酵菌种和发酵工艺，提高蜂蜜醋中非挥发酸含量，丰富蜂蜜醋酸感，改善蜂蜜醋的口感与风味。
本发明的首要目的是提供一种多菌种复合发酵蜂蜜醋的方法。
本发明上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种多菌种复合发酵蜂蜜醋的方法，包括如下步骤：
s1.分别将醋化醋杆菌(acetobacteraceti)、汉氏葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacterhansenii)、欧洲驹形杆菌(komagataeibactereuropaeus)活化、制备种子培养液；
s2.将蜂蜜加水稀释至含糖量为15％～25％，经灭菌后冷却得到蜂蜜水；
s3.向步骤s2得到的蜂蜜水中接种5～12％的种子培养液进行发酵得到蜂蜜醋发酵液，所述种子培养液为体积比为1～2：1～2：1～2的醋化醋杆菌(acetobacteraceti)种子培养液、汉氏葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacterhansenii)种子培养液、欧洲驹形杆菌(komagataeibactereuropaeus)种子培养液；
s4.将蜂蜜醋发酵液转移至陈化罐中保存20～50天得到蜂蜜醋。
本发明上述蜂蜜醋发酵方法通过将几种不同的产酸菌进行复配发酵蜂蜜醋，有效地提高了蜂蜜醋中非挥发酸含量，中和了蜂蜜醋刺激的口感，使得蜂蜜醋入口更加醇厚，口感柔和，有效缩短酿造周期，改善其风味品质。
作为一种优选的可实施方式，步骤s3接种体积比为1：1：1或1：1：2或1：2：1或2：1：1的醋化醋杆菌(acetobacteraceti)种子培养液、汉氏葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacterhansenii)种子培养液、欧洲驹形杆菌(komagataeibactereuropaeus)种子培养液。
优选地，步骤s1所述活化、制备种子培养液具体为：接种环挑取菌体接种至斜面培养基中，28～33℃培养2～4d；再将斜面培养基中的菌体接种至种子液培养基中，28～33℃摇床培养3～4d；取一代种子液按5％～8％接种量再次接入种子液培养基中，28～33℃摇床培养3～4d，得到种子培养液。
优选地，所述斜面培养基的制备方法为：向纯水中加入1％酵母浸膏，0.5％蛋白胨，5％葡萄糖，2％琼脂粉，在121℃灭菌20min得到。
优选地，所述种子液培养基的制备方法为：向纯水中加入蜂蜜，调整糖度为13brix，加入6％营养盐，在105℃灭菌20min得到。
优选地，步骤s2所述灭菌为巴氏灭菌。
优选地，步骤s2所述冷却为冷却至40～50℃。
优选地，步骤s3所述蜂蜜水中接种种子培养液为同时接种或顺序接种。
进一步优选地，所述顺序接种为先接入汉氏葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacterhansenii)和欧洲驹形杆菌(komagataeibactereuropaeus)种子培养液，48～72h后再接入醋化醋杆菌(acetobacteraceti)种子培养液。
优选地，步骤s3所述发酵的具体条件为：蜂蜜水调整酒精度为3～6％vol，发酵过程中控制通氧量，28～33℃培养12～16d。
进一步优选地，所述控制通氧量为：在接种发酵0～6天内，持续通氧，通氧量为1.2～1.7m3/h，在后续发酵过程中，每隔12h通一次氧，通氧时间为12h，通氧量为0.5～0.9m3/h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的多菌种复合发酵蜂蜜醋的方法，通过有效复合发酵菌种和控制发酵工艺，制备得到的蜂蜜醋总酸超过40g/l，非挥发酸为8.5～13g/l，可提高蜂蜜醋中非挥发酸含量，蜂蜜醋口感更加柔和，酸感丰满；另外，本发明制备得到的蜂蜜醋中挥发性香气物质共有56种，包含5种酸类物质，6种醇类物质，14种酯类物质，10种酮类物质，8种醛类物质，7种呋喃类物质，1种醚类物质，2种酚类物质，3种烯烃类物质，有效改善和丰富蜂蜜醋的口感与风味，醋香浓郁柔不刺激，蜜香突出，香味宜人舒适。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
感官评分方法：
所有蜂蜜醋样品均采用统一的容器盛装并采用3位数字随机编号，由感官鉴赏小组进行感官评价。感官鉴赏小组由10名食品专业研究生及老师组成，模糊感官评分表见表1所示。
表1蜂蜜醋感官评价标准
实施例1一种多菌种复合发酵蜂蜜醋的酿造方法
s1.将醋化醋杆菌、汉氏葡糖酸醋杆菌、欧洲驹形杆菌分别活化至种子液培养基中：用接种环挑取少量菌体接种至斜面培养基中，28℃培养4d；再将斜面培养基中的菌体接种至种子液培养基中，28℃摇床培养4d；取一代扩培液按8％接种量接入种子液培养基中，28℃摇床培养3d，分别得到醋酸发酵菌种子培养液；
其中，所述斜面培养基的制备方法包括如下步骤：向纯水中加入1％wt酵母浸膏，0.5％wt蛋白胨，5％wt葡萄糖，2％wt琼脂粉，在121℃灭菌20min。
所述种子液培养基的制备方法包括如下步骤：纯水加入蜂蜜，调整糖度为13brix，加入6wt％营养盐，在105℃灭菌20min。
s2.将蜂蜜加水稀释至含糖量在18％，经巴氏灭菌之后迅速冷却至40℃。
s3.向步骤s2得到的蜂蜜水中接种5％的种子培养液进行发酵得到蜂蜜醋发酵液，所述种子培养液为体积比为1：1：1的醋化醋杆菌种子培养液、汉氏葡糖酸醋杆菌种子培养液、欧洲驹形杆菌种子培养液；
其中，所述接种方式为先接入汉氏葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacterhansenii)和欧洲驹形杆菌(komagataeibactereuropaeus)种子培养液，72h后再接入醋化醋杆菌(acetobacteraceti)种子培养液；所述发酵的具体条件为：蜂蜜水调整酒精度为4.5％vol，发酵过程中控制通氧量，在接种发酵前6天内，持续通氧，通氧量为1.4m3/h，在后续发酵过程中，每隔12h通一次氧，通氧时间为12h，通氧量为0.9m3/h，33℃培养12d得到蜂蜜醋发酵液。
s4.将蜂蜜醋发酵液转移至陈化罐中保存20天得到蜂蜜醋。
通过上述方法制备得到的蜂蜜醋总酸含量为37.395g/l，非挥发酸含量为11.076g/l，醋香浓郁柔不刺激，蜜香突出，香味宜人舒适，感官评分为89.6分。
实施例2一种多菌种复合发酵蜂蜜醋的酿造方法
s1.将醋化醋杆菌、汉氏葡糖酸醋杆菌、欧洲驹形杆菌分别活化至种子液培养基中：用接种环挑取少量菌体接种至斜面培养基中，33℃培养2d；再将斜面培养基中的菌体接种至种子液培养基中，33℃摇床培养3d；取一代扩培液按8％接种量接入种子液培养基中，33℃摇床培养4d，分别得到醋酸发酵菌种子培养液；
其中，所述斜面培养基的制备方法包括如下步骤：向纯水中加入1wt％酵母浸膏，0.5wt％蛋白胨，5wt％葡萄糖，2wt％琼脂粉，在121℃灭菌20min。
所述种子液培养基的制备方法包括如下步骤：纯水加入蜂蜜，调整糖度为13brix，加入6wt％营养盐，在105℃灭菌20min。
s2.将蜂蜜加水稀释至含糖量在18％，经巴氏灭菌之后迅速冷却至40℃。
s3.向步骤s2得到的蜂蜜水中接种8％的种子培养液进行发酵得到蜂蜜醋发酵液，所述种子培养液为体积比为1：1：2的醋化醋杆菌种子培养液、汉氏葡糖酸醋杆菌种子培养液、欧洲驹形杆菌种子培养液；
其中，所述接种方式为先接入汉氏葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacterhansenii)和欧洲驹形杆菌(komagataeibactereuropaeus)种子培养液，48h后再接入醋化醋杆菌(acetobacteraceti)种子培养液；所述发酵的具体条件为：蜂蜜水调整酒精度为3％vol，发酵过程中控制通氧量，在接种发酵前6天内，持续通氧，通氧量为1.7m3/h，在后续发酵过程中，每隔12h通一次氧，通氧时间为12h，通氧量为0.5m3/h，28℃培养12d得到蜂蜜醋发酵液。
s4.将蜂蜜醋发酵液转移至陈化罐中保存50天得到蜂蜜醋。
该方法制备得到的蜂蜜醋风味较好，总酸为40.465g/l，非挥发酸为12.889g/l，醋香浓郁柔不刺激，蜜香突出，香味宜人舒适，感官评分为93.4分。
采用gc-ms对制备得到的蜂蜜醋中挥发性香气物质进行检测，本实施例制备得到的蜂蜜醋中挥发性香气物质共有56种，包含5种酸类物质，6种醇类物质，14种酯类物质，10种酮类物质，8种醛类物质，7种呋喃类物质，1种醚类物质，2种酚类物质，3种烯烃类物质。
实施例3一种多菌种复合发酵蜂蜜醋的酿造方法
s1.将醋化醋杆菌、汉氏葡糖酸醋杆菌、欧洲驹形杆菌分别活化至种子液培养基中：用接种环挑取少量菌体接种至斜面培养基中，30℃培养3d；再将斜面培养基中的菌体接种至种子液培养基中，30℃摇床培养3d；取一代扩培液按8％接种量接入种子液培养基中，30℃摇床培养3d，分别得到醋酸发酵菌种子培养液；
其中，所述斜面培养基的制备方法包括如下步骤：向纯水中加入1wt％酵母浸膏，0.5wt％蛋白胨，5wt％葡萄糖，2wt％琼脂粉，在121℃灭菌20min。
所述种子液培养基的制备方法包括如下步骤：纯水加入蜂蜜，调整糖度为13brix，加入6wt％营养盐，在105℃灭菌20min。
s2.将蜂蜜加水稀释至含糖量在15％，经巴氏灭菌之后迅速冷却至50℃。
s3.向步骤s2得到的蜂蜜水中接种12％的种子培养液进行发酵得到蜂蜜醋发酵液，所述种子培养液为体积比为1：2：1的醋化醋杆菌种子培养液、汉氏葡糖酸醋杆菌种子培养液、欧洲驹形杆菌种子培养液；
其中，所述接种方式为同时接入汉氏葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacterhansenii)、欧洲驹形杆菌(komagataeibactereuropaeus)、醋化醋杆菌(acetobacteraceti)种子培养液；所述发酵的具体条件为：蜂蜜水调整酒精度为4.5％vol，发酵过程中控制通氧量，在接种发酵前4天内，持续通氧，通氧量为1.4m3/h，在后续发酵过程中，每隔12h通一次氧，通氧时间为12h，通氧量为0.8m3/h，30℃培养10d得到蜂蜜醋发酵液。
s4.将蜂蜜醋发酵液转移至陈化罐中保存30天得到蜂蜜醋。
该方法制备得到的蜂蜜醋风味较好，总酸为38.547g/l，非挥发酸为10.363g/l，醋香浓郁柔不刺激，蜜香突出，香味宜人舒适，感官评分为85.9分。
实施例4一种多菌种复合发酵蜂蜜醋的酿造方法
s1.将醋化醋杆菌、汉氏葡糖酸醋杆菌、欧洲驹形杆菌分别活化至种子液培养基中：用接种环挑取少量菌体接种至斜面培养基中，32℃培养3d；再将斜面培养基中的菌体接种至种子液培养基中，32℃摇床培养3d；取一代扩培液按9％接种量接入种子液培养基中，32℃摇床培养3d，分别得到醋酸发酵菌种子培养液；
其中，所述斜面培养基的制备方法包括如下步骤：向纯水中加入1wt％酵母浸膏，0.5wt％蛋白胨，5wt％葡萄糖，2wt％琼脂粉，在121℃灭菌20min。
所述种子液培养基的制备方法包括如下步骤：纯水加入蜂蜜，调整糖度为13brix，加入6wt％营养盐，在105℃灭菌20min。
s2.将蜂蜜加水稀释至含糖量在25％，经巴氏灭菌之后迅速冷却至50℃。
s3.向步骤s2得到的蜂蜜水中接种6％的种子培养液进行发酵得到蜂蜜醋发酵液，所述种子培养液为体积比为2：1：1的醋化醋杆菌种子培养液、汉氏葡糖酸醋杆菌种子培养液、欧洲驹形杆菌种子培养液；
其中，所述接种方式为同时接入汉氏葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacterhansenii)、欧洲驹形杆菌(komagataeibactereuropaeus)、醋化醋杆菌(acetobacteraceti)种子培养液；所述发酵的具体条件为：蜂蜜水调整酒精度为6％vol，发酵过程中控制通氧量，在接种发酵前6天内，持续通氧，通氧量为1.2m3/h，在后续发酵过程中，每隔12h通一次氧，通氧时间为12h，通氧量为0.9m3/h，28℃培养16d得到蜂蜜醋发酵液。
s4.将蜂蜜醋发酵液转移至陈化罐中保存40天得到蜂蜜醋。
该方法制备得到的蜂蜜醋风味较好，总酸为41.318g/l，非挥发酸为8.873g/l，醋香浓郁柔不刺激，蜜香突出，香味宜人舒适，感官评分为80分。
对比例1
同实施例2的方法，具体的区别在于步骤s2所接种的种子培养液为体积比为3：3：1的汉氏葡糖酸醋杆菌种子培养液、欧洲驹形杆菌种子培养液、醋化醋杆菌种子培养液。
该方法制备得到的蜂蜜醋风味较好，总酸为34.069g/l，非挥发酸为8.809g/l，感官评分为77.5分。
对比例2
同实施例2的方法，具体的区别在于步骤s2所接种的种子培养液为体积比为1：1：3的汉氏葡糖酸醋杆菌种子培养液、欧洲驹形杆菌种子培养液、醋化醋杆菌种子培养液。
该方法制备得到的蜂蜜醋风味较好，总酸为38.291g/l，非挥发酸为7.319g/l，感官评分为78.1分。
对比例3
同实施例2的方法，具体的区别在于步骤s2所接种的种子培养液为体积比为1：1的醋化醋杆菌种子培养液、汉氏葡糖酸醋杆菌种子培养液。
该方法制备得到的蜂蜜醋风味较好，总酸为33.771g/l，非挥发酸为7.902g/l，感官评分为74.5分。
对比例4
同实施例2的方法，具体的区别在于步骤s2所接种的种子培养液为体积比为1：2的醋化醋杆菌种子培养液、欧洲驹形杆菌种子培养液。
该方法制备得到的蜂蜜醋风味较好，总酸为34.368g/l，非挥发酸为8.355g/l，感官评分为76.2分。
对比例5
同实施例2的方法，具体的区别在于步骤s2所接种的种子培养液为体积比为1：2的汉氏葡糖酸醋杆菌种子培养液、欧洲驹形杆菌种子培养液。
该方法制备得到的蜂蜜醋风味较好，总酸为28.356g/l，非挥发酸为9.975g/l，感官评分为71.3分。
对比例6
同实施例2的方法，具体的区别在于步骤s3所接种的种子培养液的接种量为3％。
该方法制备得到的蜂蜜醋风味较好，总酸为23.58g/l，非挥发酸为6.542g/l，感官评分为58.5分。
对比例7
同实施例2的方法，具体的区别在于步骤s3所接种的种子培养液的接种量为15％。
该方法制备得到的蜂蜜醋风味较好，总酸为27.33g/l，非挥发酸为7.578g/l，感官评分为59.6分。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。