一种表达冠状病毒受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达冠状病毒受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体。

背景技术：

新冠肺炎的临床症状包括发热、干咳、乏力等，患者可出现鼻塞、流涕、咽痛、结膜炎等多种症状，重症患者可出现呼吸困难、低氧血症，严重者可发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克等甚至导致死亡。

疫苗接种是预防新冠病毒的最有效手段之一，目前各国已有多个研究机构进行新冠疫苗的制备，包括灭活疫苗，重组蛋白疫苗，重组腺病毒疫苗，mrna疫苗以及病毒载体疫苗等。灭活疫苗可以有效地激发高水平的体液免疫，相对安全，但不能诱导细胞毒t淋巴细胞反应，不能够产生局部免疫反应；重组蛋白疫苗技术成熟，不良反应小，但生产速度较慢；重组腺病毒疫苗虽然免疫效果好，但可能会存在一定的不良反应，且人体内可能含有针对腺病毒载体的抗体，会影响疫苗效果；mrna疫苗相对效果好，但存储运输条件相对较为苛刻，成本较高。

病毒载体疫苗具有多种优势，由于是活病毒载体，可在免疫动物体内进行复制，诱导较强的免疫反应；可通过自然感染，如滴鼻、喷雾等方式进行免疫；可产生体液免疫与细胞免疫，除了激发全身免疫反应外，还可激发局部免疫反应，如在呼吸道中产生siga抗体，发挥较强的免疫保护效果。目前，在新冠疫苗的研发过程中，已有多种病毒载体疫苗在研发过程中，并在动物模型中具有良好的免疫保护效果，如黄热病毒、痘病毒、新城疫病毒、水疱口炎病毒等。副流感病毒5型(piv5)作为预防犬窝咳的疫苗在犬中应用已有数十年的历史，而且未被证实可引起任何其他动物包括人致病。

技术实现要素：

本发明提供一种表达冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体(tandemrepeatreceptor-bindingdomain,tr-rbd)的重组副流感病毒5型载体，

所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述副流感病毒5型基因组包含冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体的基因序列。

可选的，所述冠状病毒为2019-ncov。

可选的，所述副流感病毒5型基因组为：用序列甲替换一种副流感病毒5型基因组的小疏水蛋白基因核苷酸序列，所得；

所述序列甲为如下1)或2)或3)：

a)seqidno：1所示dna分子；

b)在严格条件下与a)限定的dna分子杂交且编码所述冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体的dna序列；

c)与a)或b)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体的dna序列。

可选的，所述表达冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体的基因序列如seqid：no：1所示；所述表达冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体基因序列编码的蛋白的氨基酸序列为seqid：no：2所示。

可选的，所述副流感病毒5型基因组为将seqidno：6所示的核苷酸序列的第6303-6437位的核苷酸序列替换为seqidno：1所示的核苷酸序列。

一种组合物，包括重组副流感病毒5型载体、表达辅助蛋白的辅助重组质粒—np、辅助重组质粒—p和辅助重组质粒—l；所述表达辅助蛋白的辅助重组质粒—np、辅助重组质粒—p和辅助重组质粒—l是将副流感病毒5型的np、p和l蛋白的编码基因分别插入哺乳动物表达载体中，得到辅助重组质粒—np、辅助重组质粒—p和辅助重组质粒—l，。

可选的，np蛋白的氨基酸序列如seqidno：3所示；p蛋白的氨基酸序列如seqidno：4所示；l蛋白的氨基酸序列如seqidno：5所示。

可选的，哺乳动物表达载体为pcdna3.1(+)。

所述冠状病毒为2019-ncov。

一种在细胞中表达冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体的方法，该方法包括使该细胞与上述的重组副流感病毒5型载体相接触。

一种表达冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体的制备方法，包括如下步骤：

1)将副流感病毒5型全基因组反转录得到的cdna插入克隆载体中，得到重组质粒ppiv5；

2)用序列甲替换步骤1)中重组质粒ppiv5中副流感病毒5型的小疏水蛋白基因核苷酸序列；所述序列乙为如下1)或2)或3)：

a)seqidno：1所示dna分子；

b)在严格条件下与a)限定的dna分子杂交且编码所述冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体的dna序列；

c)与a)或b)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体的dna序列。

可选的，步骤1)中所述克隆载体为带有t7rna聚合酶启动子序列、带有丁肝核酶序列、t7rna聚合酶转录终止序列的克隆载体。

一种新型冠状病毒(2019-ncov)疫苗的制备方法，所述疫苗的制备方法包括如下步骤：将表达冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体、表达辅助蛋白的辅助重组质粒—np、辅助重组质粒—p和辅助重组质粒—l共转染宿主细胞。

可选的，所述宿主细胞为bsr-t7细胞，mdbk细胞,vero细胞或bhk细胞。

上述方法制备得到的疫苗。

重组副流感病毒5型载体或上述方法制备的重组副流感病毒5型载体在如下任一一种中的应用：

(1)制备提高动物体内针对冠状病毒2019-ncovspike蛋白抗体水平的产品中的应用；

(2)制备预防或辅助预防冠状病毒2019-ncov引起的疾病产品中的应用。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供一种表达冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述副流感病毒5型基因组包含冠状病毒spike蛋白的受体结合域串联二聚体的基因序列。

实验第1、第15天，两次向balb/c小鼠滴鼻接种疫苗(重组副流感病毒5型rpiv5-tr-rbd)，免疫重组病毒rpiv5-tr-rbd组小鼠体内产生针对新冠病毒spike蛋白的特异性抗体，而rpiv5对照组小鼠未能检测到针对新冠病毒spike蛋白的特异性抗体。表明rpiv5-tr-rbd重组病毒免疫小鼠能够刺激小鼠产生针对spike蛋白的特异性抗体。

实验第1、第15天，两次向balb/c小鼠滴鼻接种rpiv5-tr-rbd，首免后6周，鼻腔接种2019-ncov冠状病毒；小鼠攻毒后第3天剖杀，肺脏病原核酸检测结果表明2019-ncov冠状病毒不能在小鼠肺脏中有效复制。rpiv5-tr-rbd对2019-ncov冠状病毒具有优良的免疫保护效果。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.利用rt-pcr对rpiv5-tr-rbd病毒基因组中二聚体rbd基因进行鉴定；

图2.利用间接免疫荧光对rpiv5-tr-rbd重组病毒感染细胞rbd蛋白表达情况进行鉴定；

图3.利用westernblot对rpiv5-tr-rbd重组病毒感染细胞rbd蛋白表达情况进行鉴定；

图4.elisa检测小鼠免疫1-4周后血清中针对sars-cov-2spike蛋白igg抗体水平；

图5.qpcr检测新冠病毒s、n、orf基因在感染免疫后小鼠肺脏中的rna水平；

图6.重组质粒ppiv5的图谱。

具体实施方式

下述pbluescriptskii(+)-1载体，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1

1.重组副流感病毒5型的制备

1.1piv5反向遗传操作系统质粒的构建

1、合成载体病毒piv5为本实验室在山东省某猪场健康猪体内分离得到的病毒株(命名为chnsd-011)，利用rocherna提取试剂盒对该毒株提取rna并利用primescript^tmii1ststrandcdnasynthesiskit反转录，获得毒株的cdna。将piv5基因组全长15246nt(见seqidno：6)分为a-c共3个约5-5.5kb大小片段，a片段为piv5基因组全长(5’-3’)的第1bp-5030bp，b片段为piv5基因组全长(5’-3’)的第5016bp-9906bp，c片段为piv5基因组全长(5’-3’)的第9892-15246bp。利用引物分别进行pcr扩增，将dna片段回收后的a、b和c分别插入peasy-bluntzero载体，经测序确认序列无误后保留，三片段的质粒分别命名为pzero-a、pzero-b与pzero-c。

2、改造pbluescriptskii(+)(优宝生物，货号为vt1328)，改造后载体5’端带有t7rna聚合酶启动子序列，3’端带有丁肝核酶序列和t7rna聚合酶转录终止序列的pbluescriptskii(+)，其他序列不变，改造后的载体命名为pbluescriptskii(+)-1，将步骤1中得到的三个质粒，利用引物进行pcr扩增，获得分为三段(a、b、c)的piv5全基因组，将piv5全基因组与pbluescriptskii(+)-1进行同源重组连接，得到重组质粒ppiv5，重组质粒ppiv5图谱见图6(即在pbluescriptskii(+)-1的多克隆位点插入序列seqidno：6)，测序验证正确并保留。

3、以ppiv5为模板，以sphi-f(seqidno：7)与sphi-r(seqidno：8)引物扩增片段sphi，并在片段3’端引入pmei酶切位点；以bbvci-f(seqidno：9)与bbvci-r(seqidno：10)引物扩增片段bbvci，并在引物5’端引入pmei酶切位点，将两片段回收备用。

4、利用sphi-f与bbvci-r引物扩增片段sphi和bbvci，扩增得到的目的片段为将sphi和bbvci片段中的小疏水蛋白基因替换为pmei识别序列，命名为△sh(此步骤的目的为引入pmei识别序列，删除小疏水蛋白基因)。

5、利用sphi与bbvci双酶切ppiv5载体，回收后与片段△sh进行同源重组，获得携带有pmei酶切位点的载体vpiv5-pmei。vpiv5-pmei载体为将重组质粒ppiv5中的小疏水蛋白基因(sh，为seqidno：6的第6303-6437位)替换为pmei识别序列的片段，其他序列保持不变，得到的载体。

6、利用基因np、p和l特异性引物对(np的引物对为np-f、np-r；p的引物对为p-f、p-r；l的引物对为l-f、l-r)，步骤2中得到的重组质粒ppiv5进行扩增，获得np的基因序列为基因组全长152位到1681位(np蛋白的氨基酸序列如seqidno：3所示)，p的基因序列为基因组全长1850位到3026位(p蛋白的氨基酸序列如seqidno：4所示)，l的基因序列为基因组全长序列8414位到15181位(l蛋白的氨基酸序列如seqidno：5所示)。将np的基因序列插入购自invitrogen公司的pcdna3.1(+)(货号：v790-20)的hindiii位点，获得可在真核细胞中表达病毒蛋白np的重组质粒pcdna-np；将p的基因序列插入pcdna3.1(+)的hindiii位点，获得可在真核细胞中表达病毒蛋白p的重组质粒pcdna-p；将l的基因序列插入pcdna3.1(+)的hindiii位点，获得可在真核细胞中表达病毒蛋白l的重组质粒pcdna-l。

1.2重组病毒rpiv5感染性克隆的获得

1、将纯化提取所得步骤1.1中的ppiv5、pcdna-np、pcdna-p与pcdna-l共转染稳定表达t7rna聚合酶的bsrt7/5细胞。

2、完成步骤1后72h，将转染后的bsrt7/5细胞与上清置于-80℃冻融后，接种mdbk细胞，4h后更换为含有2％fbs的dmem培养基。

3、完成步骤2后72h，吸取细胞上清液，接种新的mdbk细胞，4h后更换为含有2％fbs的dmem培养基。

完成步骤3后72h，重复步骤3一次，取细胞上清接种至新的mdbk细胞。72h后，吸取mdbk细胞上清液进行血凝检测，能够产生血凝现象的上清液即为拯救成功的重组rpiv5，进行后续的检测与鉴定工作。

2.表达新冠病毒rbd二聚体蛋白的重组副流感病毒5型的制备

2.1表达rbd二聚体蛋白piv5反向遗传操作系统质粒的构建

1、利用primestarhs高保真酶对新冠病毒wuhan-1毒株severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2isolatewuhan-hu-1表达spike蛋白质粒pcdna-spike(受赠于博迈德公司，spikeproteinofsars-cov-2activatesmacrophagesandcontributestoinductionofacutelunginflammationsinmice.https://doi.org/10.1101/2020.12.07.414706)进行扩增，分别使用引物rbd-di-1f、rbd-di-1r，rbd-di-2f、rbd-di-2r两引物对扩增rbd区域序列，扩增得到的两个dna片段分别命名为r1和r2，电泳鉴定无误后对两个片段进行回收。

2、同一pcr反应体系中，利用引物rbd2-fu-f、rbd2-fu-r，以片段r1,r2为模板进行扩增，获得r1，r2片段融合产物rbd12(冠状病毒s蛋白的受体结合域二聚体基因)，冠状病毒s蛋白(spike蛋白)的受体结合域二聚体基因的序列见seqidno：1，将两融合片段产物电泳鉴定无误后回收dna产物备用。

3、利用pmei酶对携带有pmei酶切位点的1.1中的vpiv5-pmei载体进行酶切线性化处理，获得载体片段ppiv5-pmei，将其回收备用。

4、以步骤3中的片段ppiv5-pmei为载体，与步骤2中的rbd12片段进行同源重组连接，得到重组质粒rpiv5-tr-rbd，测序无误后保留备用。重组质粒rpiv5-tr-rbd为在vpiv5-pmei载体的pmei识别位点处插入seqidno：1所示的dna分子所得。

2.2表达rbd二聚体蛋白重组piv5的拯救

1、将纯化提取所得2.1中的rpiv5-tr-rbd、pcdna-np、pcdna-p与pcdna-l四质粒共转染表达t7rna聚合酶的bsrt7/5细胞。

2、完成步骤1后72h，将bsrt7/5细胞与上清置于-80℃冻融后，接种mdbk细胞，4h后更换为含有2％fbs的dmem培养基。

3、完成步骤2后72h，吸取细胞上清液，接种新的mdbk细胞，4h后更换为含有2％fbs的dmem培养基。

4、完成步骤3后72h，重复步骤3一次，接种至新的mdbk细胞。72h后，吸取mdbk细胞上清液进行血凝检测，能够产生血凝的上清液即为拯救成功的重组rpiv5-tr-rbd，进行后续的检测与鉴定工作。

3.重组病毒rpiv5-tr-rbd的鉴定

一、基因鉴定

提取重组病毒rpiv5-tr-rbd基因组rna，进行反转录获得cdna后，利用引物sh-jf与sh-jr对(序列见下表)包含有插入二聚体rbd基因的病毒基因组区域进行pcr扩增，获得pcr扩增产物。

表1

试验结果见图1，pcr扩增产物片段为1688bp，片段大小符合预期，经sanger测序后确认，rbd二聚体基因序列已完全插入piv5基因组中，且序列准确无误。

二、间接免疫荧光鉴定

1、取12孔细胞培养板，加入1ml含有2x10⁵个mdbk细胞的含10％fbs的dmem培养液，于37℃、5％co2培养过夜，至mdbk细胞长至90％密度。

2、完成步骤1后，利用ph为7.2、0.01m的pbs缓冲液清洗细胞两次，弃去液体，更换为含2％fbs的dmem培养基1ml，并接种重组病毒rpiv5-tr-rbd10³tcid50，继续培养48h。

3、完成步骤2后，弃去细胞孔中上清，利用ph7.2、0.01m的pbs缓冲液洗涤2次，之后每孔加入1ml预冷的固定液(乙醇与丙酮按照3:2体积比混合配制而成)，静置20min，进行细胞固定与透化。

4、完成步骤3后，弃去孔中液体，每孔利用1mlpbs缓冲液洗涤3次，每次5min；之后每孔加入500μl鼠抗piv5稀释液，4℃过夜孵育8h。将鼠抗piv5替换为兔抗sars-cov-2病毒spike蛋白多克隆抗体稀释液进行实验，检测毒rbd二聚体蛋白的表达。两种抗体稀释液均由1体积份抗体和199体积份ph7.2、0.01m的pbs缓冲液混合而成(鼠抗piv5稀释液购自武汉华美生物，货号：csb-ma000160，兔抗sars-covspike蛋白抗体，购自义翘神州，货号为40150-t62-cov2)。

5、完成步骤4后，弃去液体，利用pbs缓冲液1ml洗涤3次，每次5min；而后加入tritc基团标记的羊抗鼠二抗稀释液(该稀释液的制备方法为将羊抗鼠二抗(以1:400体积比利用pbs缓冲液稀释)进行抗原抗体结合染色，37℃避光孵育1h。羊抗鼠二抗购自biovision公司，货号：6921-100。

6、完成步骤5后，弃去孔内液体，利用pbs缓冲液1ml洗涤3次，每次5min；而后加入fitc基团标记的羊抗兔二抗稀释液(该稀释液的制备方法为将羊抗兔二抗以1:200体积比利用pbs缓冲液稀释)，进行抗原抗体结合染色，37℃避光孵育1h。羊抗兔二抗购自碧云天生物技术有限公司，货号：a0562。

7、完成步骤6后，弃去孔内液体，利用pbst缓冲液1ml洗涤3次，每次5min，最后一次保留孔内pbst缓冲液不弃去，置于倒置荧光显微镜下观察。将重组病毒rpiv5-tr-rbd替换为重组野生病毒rpiv5作为对照。

试验结果见图2。结果表明，重组病毒rpiv5-tr-rbd感染mdbk细胞48h后，可在细胞中检测到表达的piv5p蛋白(红色)与新冠病毒rbd二聚体蛋白(绿色)；而重组野生病毒rpiv5感染细胞后仅能检测到piv5p蛋白(红色)，不能检测到新冠病毒rbd二聚体蛋白的表达。

三、westernblot鉴定

1、取6孔细胞培养板，加入2ml含有mdbk细胞的细胞培养液(约4×10⁵个mdbk细胞/孔)，37℃、5％co2培养过夜，直至mdbk细胞生长成单层至约90％密度。

2、完成步骤1后，利用2mlpbs洗涤细胞三次，接种重组病毒rpiv5-tr-rbd或rpiv5(接种剂量为10⁴tcid50)并更换为含2％fbs的dmem培养液，37℃、5％co2培养48h。

3、取完成步骤2的细胞，pbs洗涤三次后，使用胰蛋白酶消化后，离心，收集细胞。

4、完成步骤3后，取所述细胞，利用ip裂解液进行裂解，得到细胞裂解液，10000g离心10min后小心吸取上清，加入westernproteinloadingbuffer，100℃变性10min后冷却至室温。

5、完成步骤4后，将所述细胞裂解液进行sds-page和westernblot，采用兔抗新冠病毒spike蛋白多克隆抗体(sinobiological公司，0150-t62-cov2)作为一抗、辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗兔抗体(碧云天生物技术有限公司，货号：a0208)作为二抗检测rbd二聚体蛋白；利用piv5p蛋白作为内参，鼠抗p蛋白v5标签单克隆抗体(武汉华美生物技术有限公司，货号：csb-ma000160)为一抗，hrp标记羊抗鼠抗体(abcam公司，货号：ab6789)作为二抗。

实验结果见图3。结果表明，重组病毒rpiv5-tr-rbd感染的mdbk细胞中能够在60kd大小位置检测rbd二聚体蛋白特异性条带，而rpiv5感染的mdbk细胞中未检测到该特异性条带，表明重组病毒rpiv5tr-rbd感染细胞后可表达新冠病毒二聚体化rbd蛋白。

4、重组病毒rpiv5-tr-rbd对新冠病毒sars-cov-2的免疫保护效果评价

将20只6周龄balb/c小鼠随机分成两组，每组10只。实验组鼻腔接种50μl重组病毒rpiv5-tr-rbd，对照组鼻腔接种50μl重组病毒rpiv5，接种剂量均为10⁶tcid50/只。首次接种后15天，重复上述操作一次。免疫后持续观察每组小鼠的临床症状：包括是否出现食欲不振，被毛凌乱，呼吸困难和活动量减少行为。

观察发现，rpiv5对照组与rpiv5-tr-rbd免疫组均未出现明显的临床症状，饮食正常，体重保持相对稳定。表明本研究构建的重组rpiv5及表达新冠病毒spike蛋白rbd区域二聚体蛋白的rpiv5-tr-rbd重组毒对小鼠无副反应或不良反应，安全性良好。

在首次免疫后每间隔7天利用眼眶后静脉丛法采集小鼠血液，37℃静置50min，8000rpm离心15min，收集血清，分装后-80℃保存。利用间接elisa方法对小鼠体内针对spike蛋白抗体水平进行检测。

间接elisa方法的步骤为：

1)包板，用elisacoatingbuffer(索莱宝公司，c1055)稀释sars-2-s(vazyme,货号：cg202-00)到1μg/ml，每孔加50μl，4℃孵育过夜。

2)移除抗原溶液，用pbs清洗3次。

3)封闭，每孔加100μl封闭液(含5％脱脂乳pbs缓冲液)，在37℃孵育至少1小时。

4)移除封闭液，用pbs洗板3次；

5)用血清孵育，用抗体稀释液(即封闭液)稀释血清到正确的比例，小鼠血清稀释从1：25开始，按照排板要求，孔里加入100μl血清稀释液，在37℃孵育2小时，阴性对照为健康鼠的血清，阳性对照要确保检测出来。

6)移除血清稀释液，用pbst洗板5次。

7)用2抗(hrp-conjugatedgoatanti-mouseigg，abcam公司，货号ab6789)孵育，2抗用抗体稀释缓冲液稀释，anti-mouseigg的稀释比例是1：5000，按照排板要求，孔里加入100μl2抗稀释液，在37℃孵育1.5小时。

8)移除2抗缓冲液，用pbst洗板5次。

9)每孔加入100μltmb显色液(beyotime，p0209)，轻微拍打孔板，使其混合均匀，在室温孵育一段时间，当阴性孔有变蓝的趋势时，每孔加入100μl终止液，终止反应。

10)用酶标仪在450nm处记录吸光值。

试验结果详见图4(图4中的“免疫后1、2、3、4周”均指“首免后”)，结果表明，免疫重组病毒rpiv5-tr-rbd组小鼠体内产生抗体针对新冠病毒spike蛋白的特异性抗体，而rpiv5对照组小鼠未能检测到针对新冠病毒spike蛋白的特异性抗体。表明rpiv5-tr-rbd重组病毒免疫小鼠能够刺激小鼠产生针对spike蛋白的特异性抗体。

首免后6周，每只小鼠滴鼻感染新冠病毒sars-cov-2，接种剂量10⁴tcid50，之后每天观察小鼠的临床症状，称量体重，并在攻毒后第3天，每组各剖检5只小鼠，采集小鼠肺脏，研磨组织，取上清液提取rna后利用实时荧光定量pcr方法检测新冠病毒rna在小鼠脏器中的水平，结果(图5)表明，新冠病毒无法在小鼠肺脏中复制，rpiv5-tr-rbd具有良好的免疫保护效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种表达冠状病毒受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1368

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgatacactcagtgtttctactgatgttcttgttaacacctacagaaagtagagtccaa60

ccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtt120

tttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgt180

gttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatgga240

gtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgta300

attagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattat360

aattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatctt420

gattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctc480

aaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaat540

ggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaat600

ggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcacca660

gcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaaagagtccaacca720

acagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagttttt780

aacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgtt840

gctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtg900

tctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaatt960

agaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataat1020

tataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgat1080

tctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaa1140

ccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggt1200

gttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggt1260

gttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagca1320

actgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaataa1368

<210>2

<211>455

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metilehisservalpheleuleumetpheleuleuthrprothrglu

151015

serargvalglnprothrgluserilevalargpheproasnilethr

202530

asnleucyspropheglygluvalpheasnalathrargphealaser

354045

valtyralatrpasnarglysargileserasncysvalalaasptyr

505560

servalleutyrasnseralaserpheserthrphelyscystyrgly

65707580

valserprothrlysleuasnaspleucysphethrasnvaltyrala

859095

aspserphevalileargglyaspgluvalargglnilealaprogly

100105110

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