一种全细胞催化L-精氨酸合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法

文档序号：25283264发布日期：2021-06-01 17:31阅读：224来源：国知局

本发明涉及一种全细胞催化l-精氨酸合成反式-4-羟基-l-脯氨酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

反式-4-羟基-l-脯氨酸(trans-4-hyp)是重要的一种氨基酸，是胶原蛋白的主要成分。它通过允许胶原蛋白螺旋与脯氨酸的急剧扭曲而起到胶原稳定性的关键作用。hyp可以通过几种脯氨酰羟化酶使氨基酸脯氨酸羟基化产生，从而产生不同的羟脯氨酸。其中最重要的是hyp，它也是胶原蛋白中最丰富的成分。hyp已广泛应用于生物化学，食品，化妆品等领域。在微生物中hyp也涉及在放线菌素，棘白菌素，宜他霉素和纽莫康定等次级代谢物质合成。此外，hyp的衍生物之一n-乙酰基反式-4-羟基脯氨酸，作为促进骨关节炎治疗的炎症抑制剂。

利用微生物法生产hyp原对环境污染小，随着微生物资源的开发和各种合成生物学技术的迅速发展，微生物法生产trans-4-hyp具有良好的应用前景。但是目前的微生物法生产trans-4-hyp的方法还较少，催化生产的过程大多繁琐、消耗大量资源。

技术实现要素：

本发明鉴于现有技术中存在的微生物转化生产trans-4-hyp的方法较少、催化过程繁琐等问题，在传统的生产trans-4-hyp的方法的基础上，改变了之前的由脯氨酸羟化酶对l-脯氨酸进行羟化，本发明利用“提前羟化”策略，以l-精氨酸为前体，先将其羟化为4-羟基-l-精氨酸，后在精氨酸酶及鸟氨酸环化脱氨酶的级联催化下生成trans-4-hyp，为微生物发酵生产hyp提供了新的途径及生产思路。

本发明提供了鸟氨酸环化脱氨酶突变体，所述突变体以ncbi登录号为wp_010954390所示的氨基酸为亲本，将亲本的第162位和/或第205位氨基酸位氨基酸突变。

在一种实施方式中，编码所述鸟氨酸环化脱氨酶的核苷酸序列如seqidno.3所示

在一种实施方式中，所述突变体为(a)～(c)所示任一：

(a)将亲本第162位的苏氨酸突变为丙氨酸，其编码基因的核苷酸序列如seqidno.4所示；

(b)将亲本第205位的赖氨酸突变为甘氨酸，其编码基因的核苷酸序列如seqidno.5所示；

(c)将亲本第162位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第205位的赖氨酸突变为甘氨酸，其编码基因的核苷酸序列如seqidno.6所示。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

本发明提供了携带所述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体以pet28a或pacycduet-1为出发载体。

本发明提供了携带所述基因的微生物细胞。

本发明提供了一种生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的方法，以同时表达l-精氨酸羟化酶、l-精氨酸酶及所述突变体的重组菌发酵生产反式-4-羟基-l-脯氨酸。

在一种实施方式中，编码所述l-精氨酸羟化酶的核苷酸序列如seqidno.1所示。

在一种实施方式中，所述l-精氨酸酶来源于bacillusamyloliquefaciens，其编码基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

在一种实施方式中，将od600为0.6-0.8的重组菌以反应体系的5-15％量添加。

在一种实施方式中，在25-35℃下培养不少于20小时。

在一种实施方式中，采用100mm、ph7.0的na2hpo4-柠檬酸缓冲液重新悬浮重组大肠杆菌至细胞湿重为250g/l，加入细胞壁通透剂曲拉通100μl，投加20mml-精氨酸、20mmα-酮戊二酸、1mmfeso4·7h2o、5mm抗坏血酸及5mmnad⁺进行转化，转化温度为25-35℃，转化ph为7～9。

本发明提供了所述突变体，或所述微生物细胞在制备反式-4-羟基-l-脯氨酸中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供一种表达精氨酸羟化酶、精氨酸酶以及鸟氨酸环化脱氨酶，能够以l-精氨酸为底物生产trans-4-hyp的重组大肠杆菌，为微生物发酵生产hyp提供了新的途径及生产思路。本发明提供的这种微生物全细胞生产hyp的方法，具有反应条件温和、原工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。

具体实施方式

lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l(固体培养基加入2％琼脂粉)。

hplc分析：l-脯氨酸和hyp在360nm紫外波长下均有特征吸收峰，所以采用hplc法测定产物浓度。色谱条件：色谱柱：platisilods(5μl,250mm×4.6mm)；流动相a：50mm乙酸钠(含1％n,n-二甲基甲酰胺)，加水800ml，溶解后用冰醋酸调节ph至6.4(少量冰醋酸即可调至6.4)，然后加水定容至1l，混匀后用0.22μm水膜抽滤；流动相b：50％乙腈水溶液；检测器：uvdetector，检测波长：360nm，柱温：33℃，进样量：5μl，流速：1.0ml/min。

主要试剂：l-脯氨酸和hyp均购自阿拉丁公司。

所述精氨酸羟化酶的基因来源于nonribosomalpeptidege81112，编码该基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

编码所述精氨酸酶的基因来源于bacillusamyloliquefaciens(genbank：kr363261)，核苷酸序列如seqidno.2所示。

编码所述鸟氨酸环化脱氨酶的基因来源于pseudomonasputida(genbank：np_745670)，核苷酸序列如seqidno.3所示。

实施例1：鸟氨酸环化脱氨酶突变体的构建

提取pseudomonasputida基因组后，使用引物对p1和p2对扩增获得ocd，通过同源重组连接至pet28a载体中，获得重组载体pet28a-ocd。使用引物对p3和p4对pet28a-ocd进行扩增得pet28a-ocdt162a；使用引物对p5和p6对pet28a-ocd进行扩增得pet28a-ocdk205g。同时使用引物对p5和p6对pet28a-ocdt162a进行扩增得pet28a-ocdt162a/k205g。将pet28a-ocd、pet28a-ocdt162a、pet28a-ocdk205g、pet28a-ocdt162a/k205g转化进e.colibl21(de3)，获得e.colibl21/pet28a-ocd、e.colibl21/pet28a-ocdt162a、e.colibl21/pet28a-ocdk205g和e.colibl21/pet28a-ocdt162a/k205g。

将上述菌株转接到含50mllb液体培养基的锥形瓶中，于37℃的摇床中培养2h，再加入25μ诱导剂iptg，置于25℃的摇床中培养8h。离心收集细胞并用20mmkh2po4(ph8.2)洗涤，用超声波破碎细胞获得粗酶液，离心收获上清。用pd10脱盐柱和20mmkh2po4(ph8.2)纯化细胞破碎上清液。在纯化后的上清液中加入20mmkh2po4(ph8.2)和0.5mmnad⁺，30℃水浴3min。加入25mml-鸟氨酸使溶液开始反应，反应一段时间后加入50％甲酸停止反应。通过hplc测量鸟氨酸至脯氨酸的转化。用sds-page分析未纯化的提取物，并通过bradford程序以牛血清白蛋白作为标准进行蛋白定量。在tris-hcl缓冲液(50mm，ph7.5)中于30℃测定野生型ocd及其变体的动力学参数。突变体ocdt162a/k205g比酶活增加了2.41倍，此外，ocdt162a/k205g的kcat值是wt的2.85倍。

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表1ocd及其突变体动力学参数

实施例2：重组菌株构建

根据uniprot公布的nonribosomalpeptidege81112精氨酸羟化酶序列，对密码子进行优化后得到序列如seqidno.1所示的编码l-精氨酸羟化酶的基因getiqdpyf。

根据genbank公布的bacillusamyloliquefaciens(genbank：kr363261)精氨酸酶序列，对密码子进行优化后得到序列如seqidno.2所示的编码l-精氨酸酶的基因argi。

根据genbank公布的pseudomonasputida(genbank：np_745670)精氨酸羟化酶序列，对密码子进行优化后得到序列如seqidno.3所示的编码鸟氨酸环化脱氨酶的基因ocd。

利用多片段同源重组试剂盒(南京诺唯赞生物技术有限公司)对三个基因与表达质粒pet28a进行连接(三者至于t7启动子之后，并以geti、argi、ocd的顺序连接)，获得重组质粒pet28a-getiqdpyf-argi-ocd。将重组质粒pet28a-pet28a-getiqdpyf-argi-ocd用化学转化法转化至大肠杆菌e.colibl21(de3)中，挑取在lb和氨苄青霉素压力平板上长出的菌落，摇瓶培养，提取质粒进行验证，即得到重组菌e.colibl21(de3)/pet28a-getiqdpyf-argi-ocd。

将pet28a-getiqdpyf-argi-ocd质粒进行反向pcr，对ocd进行定点突变，并通过同源重组获得pet28a-getiqdpyf-argi-ocdt162a，将其用化学转化法转化至大肠杆菌e.colibl21(de3)中，挑取在lb和氨苄青霉素压力平板上长出的菌落，摇瓶培养，提取质粒进行验证，即得到重组菌e.colibl21(de3)/pet28a-getiqdpyf-argi-ocdt162a。

将pet28a-getiqdpyf-argi-ocd质粒进行反向pcr，对ocd进行定点突变，并通过同源重组获得pet28a-getiqdpyf-argi-ocdk205g，将其用化学转化法转化至大肠杆菌e.colibl21(de3)中，挑取在lb和氨苄青霉素压力平板上长出的菌落，摇瓶培养，提取质粒进行验证，即得到重组菌e.colibl21(de3)/pet28a-getiqdpyf-argi-ocdk205g。

将pet28a-getiqdpyf-argi-ocdt162a质粒进行反向pcr，对ocd进行定点突变，并通过同源重组获得pet28a-getiqdpyf-argi-ocdt162a/k205g，将其用化学转化法转化至大肠杆菌e.colibl21(de3)中，挑取在lb和氨苄青霉素压力平板上长出的菌落，摇瓶培养，提取质粒进行验证，即得到重组菌e.colibl21(de3)/pet28a-getiqdpyf-argi-ocdt162a/k205g。

实施例3：重组菌反式-4-羟基-l-脯氨酸的生产性能鉴定

将实施例1中构建的重组菌e.colibl21(de3)/pet28a-getiqdpyf-argi-ocd重组菌株进行活化并转接进lb培养基，诱导培养后收集细胞，进行全细胞转化，转化体系为10ml，温度为40℃，转化ph为9，细胞壁通透剂曲拉通10μl，加入细胞壁通透剂曲拉通100μl，投加20mml-精氨酸、20mmα-酮戊二酸、1mmfeso4·7h2o、5mm抗坏血酸及5mmnad⁺进行转化。用hplc检测转化液中的产物trans-4-hyp。检测到有产物trans-4-hyp，说明构建成功了具有转化l-脯氨酸为trans-4-hyp的重组大肠杆菌菌株。

空白对照：将质粒pet28a用转化至e.colibl21中表达，即得重组菌株e.colibl21/pet28a。挑取在lb和卡那霉素压力平板上长出的菌落，摇瓶培养，将正确的转化子转接，诱导培养后收集细胞，进行全细胞转化，转化体系为10ml，温度为40℃，转化ph为9，细胞壁通透剂曲拉通10μl，加入细胞壁通透剂曲拉通100μl，投加20mml-精氨酸、20mmα-酮戊二酸、1mmfeso4·7h2o、5mm抗坏血酸及5mmnad⁺进行转化。用hplc检测转化液中的产物hyp，结果未检测到有产物trans-4-hyp。

实施例4：生物转化生产反式-4-羟基-l-脯氨酸

将实施例1中构建的重组菌e.colibl21(de3)/pet28a-getiqdpyf-argi-ocd及其突变体重组菌株以单菌落接种于10mllb培养基中，培养12h(od600为0.6-0.8)。按10％接种量接种于装有250ml自诱导培养基的1l挡板三角瓶中，于25℃培养大约24h。收集菌体，用100ml、100mm、ph7.0的na2hpo4-柠檬酸缓冲液重新悬浮重组大肠杆菌至细胞湿重为250g/l，加入细胞壁通透剂曲拉通100μl，一次性投加20mml-精氨酸、20mmα-酮戊二酸、1mmfeso4-7h2o、5mm抗坏血酸进行转化，转化温度为30℃，转化ph为9。经过24h全细胞转化后对重组菌全细胞转化液中trans-4-hyp进行hplc测定。

表2不同菌株trans-4-hyp脯氨酸产量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

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