本发明属于发酵工业
技术领域：
，涉及一种高产焦糖香的慕萨莱思发酵酿制工艺。
背景技术：
：慕萨莱思是新疆特产，主产地在阿瓦提县，是一种酿造的味美醇香的葡萄饮品，药用价值高，富含人体所需的氨基酸、多种维生素、葡萄糖、铁等营养成分和微量元素。慕萨莱思属温性，是一种纯天然绿色饮品。焦糖香是一种赋予葡萄酒独特的浓郁香味，提高酒体品质。目前具有焦糖香气味的物质主要是呋喃物质，目前焦糖香合成方法：天然提取、化学合成，但天然提取成本过高，化学合成会产生副产物，均不适合用于慕萨莱思中提升焦糖香物质的含量。微生物发酵优势最为突出，具有合成简单，无污染的优点，非常适合在用于慕萨莱思生产中提升焦糖香物质的含量，但现有技术中并没有将微生物发酵技术用于慕萨莱思的生产过程中来提升慕萨莱思中焦糖香物质的含量的生产工艺。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种高产焦糖香的慕萨莱思发酵酿制工艺，该工艺能够提升慕萨莱思中焦糖香物质的含量。本发明的另一个目的在于提供一种高产焦糖香的慕萨莱思发酵酿制工艺，该工艺不产生副产物，环保无污染。本发明的最后一个目的在于提供一种高产焦糖香的慕萨莱思发酵酿制工艺，该工艺生产流程简单，成本低，便于推广。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明提供一种高产焦糖香的慕萨莱思发酵酿制工艺，该工艺包括以下步骤：s1：原料筛选与清洗：挑选成熟的和田红葡萄并清洗。s2：原料除梗破碎：将挑选好的葡萄，进行除梗破碎，方便压榨取汁。s3：压榨取汁：对葡萄进行压榨获得葡萄汁。s4：浓缩：将葡萄汁浓缩到糖度为23～35brix后冷却至室温，然后打入发酵罐。s5：一次接种：将活化后的f2-p85-3菌株新鲜培养液，按2％的接种量，接入到发酵罐的浓缩葡萄汁中进行一次接种。s6：降糖降氮素发酵：利用静止发酵法，将一次接种后的浓缩葡萄汁进行28℃控温发酵，每天监测糖度、酒精度和氮素水平，使得糖度不超过196g/l，氮素不超过230mg/l，酒精度不得超过8％。s7：二次接种：降糖降氮素发酵完成后，将活化后的f2-b163-2菌株新鲜培养液，按2％的接种量，接入到发酵罐的浓缩葡萄汁中进行二次接种。s8：产焦糖香发酵：将二次接种后的浓缩葡萄汁产焦糖香发酵，发酵温度为28℃，发酵至泡沫完全消失，品温回落到室温，发酵结束得到慕萨莱思成品。进一步地，采用高效液相柱前衍生法检测s1中原料的葡萄汁中总氨基酸浓度含量，保证s1中挑选红葡萄的n元素水平不低于230mg/l。进一步地，所述s3中压榨取汁保证出汁率在75％以上。进一步地，所述s5中利用ypd培养基或新鲜浓缩葡萄汁对f2-p85-3菌株进行活化，活化温度为28℃，活化时间为24h。所述f2-p85-3菌株为焦糖香风味优异的酿酒酵母菌株。进一步地，所述s6中当检测到糖浓度达到189g/l，酒精度达到6.9％，氮素浓度达到230mg/l时，进行二次发酵，发酵至泡沫回落，品温降至室温结束发酵。进一步地，所述s7中利用ypd培养基对f2-b163-2菌株进行活化，活化温度为28℃，活化时间为24h。所述f2-b163-2菌株为高产呋喃酮的菌株。进一步地，所述s8发酵过程中，每天涂布观察，确保二次接种的f2-b163-2发酵菌株正常生长，保证发酵顺利完成。进一步地，所述ypd培养基的成分包括：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％，余量的蒸馏水，所述ypd培养基的ph值为自然ph值，并用高温高压立式灭菌锅对ypd培养基进行高温高压灭菌。所述高温高压灭菌的灭菌温度为121℃，灭菌压力为0.12mpa，灭菌时间为15min。进一步地，所述f2-p85-3菌株的生物保藏信息为：分类命名：酿酒酵母，拉丁文名称：saccharomycescerevisiae；保藏单位名称：中国科学院微生物研究所；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年03月10日；保藏编号：cgmccno.21886。进一步地，所述f2-b163-2菌株的生物保藏信息为：分类命名：毕赤克鲁维酵母，拉丁文名称：pichiakluyveri；保藏单位名称：中国科学院微生物研究所；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年03月10日；保藏编号：cgmccno.21887。本发明的有益效果在于：相对于现有技术，首先，本发明的慕萨莱思采用酿酒酵母f2-p85-3与高产呋喃酮的f2-b163-2菌株复配发酵，能够有效提升慕萨莱思中焦糖香物质的含量，提升慕萨莱思的口感；其次，本工艺采用发酵的方式提升慕萨莱思中焦糖香物质，不会产生副产物，更加安全环保；最后，本生产工艺流程简单，成本低，便于推广。附图说明图1是本发明的发酵工艺流程图；图2是本发明的慕萨莱思发酵酿制工艺发酵前7天混合菌(f2-p85-3和f2-b163-2)发酵菌数浓度数据图；图3是本发明的慕萨莱思发酵酿制工艺发酵前7天对照组菌株ec1118发酵菌数浓度数据图；图4是本发明的发酵过程中混合菌(f2-p85-3和f2-b163-2)与对照组(ec1118菌株)糖浓度的变化数据图；图5是本发明的发酵过程中混合菌(f2-p85-3和f2-b163-2)与对照组(ec1118菌株)生成酒精浓度的数据图；图6是本发明的混合菌(f2-p85-3和f2-b163-2)发酵酒与对照组(ec1118)发酵酒的感官评分数据图；图7是本发明的混合菌(f2-p85-3和f2-b163-2)发酵酒与对照组(ec1118)发酵酒的呋喃物质浓度图；图8是本发明的混合菌(f2-p85-3和f2-b163-2)发酵酒与对照组(ec1118)发酵酒5-羟甲基糠醛的降解量和残余量的数据图；图9是本发明的高产焦糖香菌株(f2-b163-2)wl平板形态图；图10是本发明的感官评定菌株(f2-p85-3)wl平板形态图；图11是本发明的高产焦糖香菌株(f2-b163-2)耐受性分析，不同糖浓度下od值变化数据图；图12是本发明的高产焦糖香菌株(f2-b163-2)耐受性分析，不同糖浓度下呋喃物质生成浓度变化图；图13是本发明的高产焦糖香菌株(f2-b163-2)耐受性分析，不同n素水平下od值变化数据图；图14是本发明的高产焦糖香菌株(f2-b163-2)耐受性分析，不同n素水平下呋喃物质生成浓度变化图；图15是本发明的高产焦糖香菌株(f2-b163-2)耐受性分析，不同酒精浓度下od值变化数据图；图16是本发明的高产焦糖香菌株(f2-b163-2)耐受性分析，不同酒精浓度下呋喃物质生成浓度变化图；具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。为实现上述目的，本发明的实施如下：高产焦糖香菌株筛选：s21：选取菌株酿酒酵母菌株与非酿酒酵母菌株共65种，并对其进行编号如表1。s22：菌株的活化：将上述65种用25％甘油保藏的菌液放于已灭菌的装有1mlypd培养基中，进行接种活化。接种量为2％，(28±1)℃恒温培养24h。ypd培养基的成分为：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％，蒸馏水配制，培养基的ph值为自然ph值，并进行121℃高压灭菌15min。s23：浓缩葡萄汁制备：s231：和田红葡萄原料挑选：成熟和田红葡萄原料，挑选出青果、异物、腐烂果等。挑选完的葡萄进行清洗干净。s232：除梗：将清洗好的葡萄，经人工除梗。s233：压榨取汁：利用螺旋压榨机将除梗后的葡萄进行压榨取汁。s234：葡萄汁浓缩：将和田红葡萄汁进行煮沸热浓缩，直至糖度达到28brix。s235：封装灭菌：将浓缩好的葡萄汁，装入三角瓶，每瓶300ml，进行封口，放入立式压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间15min，冷却至室温，备用。s24：接种发酵：将上述活化好的65株待测菌液，以2％的接种量分别接入灭菌的浓缩葡萄汁，放入28℃培养箱中发酵14d，进行hlpc测定呋喃酮生成量。s25：焦糖香类物质生成量检测：用高效液相色谱分别测量上述发酵完成的的浓缩葡萄汁中的呋喃酮、乙酰呋喃和5甲基糠醛的浓度，此三者物质具有焦糖香特征，可用于判断产品中焦糖香物质含量。呋喃酮、乙酰呋喃和5甲基糠醛的浓度数据如表2。s26：焦糖香ova值结果分析：oav值为酵母菌发酵酒的香气活力值，可用于表示慕萨莱思中焦糖香含量。oav值在食品中的含量与其在特定基质(水、油等)中的香气阈值之间的比值。呋喃酮在水中的阈值为0.16mg/l，乙酰呋喃在水中的阈值为10mg/l，5-甲基糠醛在水中的阈值为466.32mg/l。通过计算得知65种菌株中呋喃酮、乙酰呋喃和5甲基糠醛的oav之和的数据如表3所述，oav总和最高的是f2-b163-2菌株，其oav值为996.21。s27：感官评定：选取七名试验人员，根据酒鼻子分辨出焦糖香气味，并对65株菌株发酵后的焦糖香气味按照1-5进行打分，1代表焦糖香气清淡，几乎没有；2-3代表焦糖香气一般，不浓郁；4-5代表焦糖香气浓郁。呋喃酮酒精水溶液。配制5个呋喃酮浓度梯度分别为200mg/l、40mg/l、8mg/l、1.6mg/l、0.32mg/l、参照液(浓度由发酵酒中检测浓度得知)，随机编号，呈递至评价员，辨别呋喃酮参照液(标度1-5分)，请评价员按评分规则及评分要求对酒样进行评分，评分结果如表4所示。由评分表4可知，菌株编号f-b18-6菌株发酵液的得分最高，其次是菌株编号f2-c507-4、菌株编号f2-p85-3，(f-b18-6菌株和f2-c507-4菌株是非酿酒酵母，菌株f2-p85-3为酿酒酵母)。综合分析，f2-b163-2菌株为产焦糖香优良的非酿酒酵母菌株，f2-p85-3菌株焦糖香感官评定最优且为酿酒酵母菌菌株。将酿酒酵母f2-p85-3与高产呋喃酮的f2-b163-2菌株时序混合发酵生产高产焦糖香的慕萨莱思生产工艺。表1：表2：表3：菌名oav值菌名oav值f2-b163-2966.21±35.12f1-7d2-04197.23±18.35f1-b256-8559.81±24.14f2-p85-3193.3±31.25c1-ar3-03410.42±26.22t-344-1192.63±27.21f2-b178-11372.52±14.54a0-y2-01191.02±43.34f2-c507-4332.46±34.24a3-18d3-01189.88±23.74i0-15d3-03327.11±39.41f0-t427-1187.99±25.68i0-15d2-08322.51±30.84go-y9187.8±42.38a1-4d5321.69±46.11g2-9d1-05182.24±25.48a4-25d1-01318.34±33.76g3-12d3-03178.23±34.44ec1118285.76±26.21f2-p88-6176.69±31.24c1-7d3-02282.82±24.33f1-x205-4176.62±27.29ho-6d5-01282.66±51.25g2-7d1-04176.21±34.21b0-3d1-06279.78±11.14g2-9d7-01173.04±27.12h0-6d2-03276.64±19.11a0-y8-02171.42±31.88f-b18-6273.99±21.74g3-12d1-04170.05±22.34a0-3d1-03270.95±27.58f1-m127-3a164.04±23.65f2-p85-1261.56±39.76g3-12d4-01159.84±33.61b0-y3-01259.78±44.28g0-y7158.71±22.05e0-1y2-004258.72±50.74f0-y2-02154.27±11.08b1-8d1258.36±16.34a3-18d1-02152.17±27.17c0-1d1-05256.18±31.34f2-a62-3150.96±9.01b3-23d1-02249.23±26.89f2-m93-20142.78±11.35f2-16d3-01249.21±16.21c2-12d2-03130.3±11.44f0-y3-02246.52±36.08f0-b163-2122.14±14.87i0-15d1-07244.74±21.07f1-l193-6118.98±21.48g2-9d2-02238.41±52.14e1-12d2-01118.55±11.38h0-6d3-03234.07±33.19f1-s487-8118.27±16.68h0-6d2-02232.8±22.21c0-y2-02117.32±11.48f1-x208-4229.99±11.31p-1l1-15114.99±31.35g0-y4228.56±21.38b0-y3-02110.99±22.21f0-l368-1227.07±31.58空白37.41±6.28e2-21d3-01224.8±22.68北京219.46±31.84g1-3d1-06221.47±21.56c2-12d1-03216.24±20.77表4：高产焦糖香的慕萨莱思发酵酿制：s1：原料筛选与清洗：挑选成熟的和田红葡萄并清洗。s2：原料除梗破碎：将挑选好的葡萄，进行除梗破碎，方便压榨取汁。s3：压榨取汁：对葡萄进行压榨获得葡萄汁。s4：浓缩：将葡萄汁浓缩到糖度为23～35brix后冷却至室温，然后打入发酵罐。s5：一次接种：将活化后的f2-p85-3菌株新鲜培养液，按2％的接种量，接入到发酵罐的浓缩葡萄汁中进行一次接种。s6：降糖降氮素发酵：利用静止发酵法，将一次接种后的浓缩葡萄汁进行28℃控温发酵，每天监测糖度、酒精度和氮素水平，使得糖度不超过196g/l，氮素不超过230mg/l，酒精度不得超过8％。s7：二次接种：降糖降氮素发酵完成后，将活化后的f2-b163-2菌株新鲜培养液，按2％的接种量，接入到发酵罐的浓缩葡萄汁中进行二次接种。s8：产焦糖香发酵：将二次接种后的浓缩葡萄汁产焦糖香发酵，发酵温度为28℃，发酵至泡沫完全消失，品温回落到室温，发酵结束得到慕萨莱思成品。采用高效液相柱前衍生法检测s1中原料的葡萄汁中总氨基酸浓度含量，保证s1中挑选红葡萄的n元素水平不低于230mg/l。所述s3中压榨取汁保证出汁率在75％以上。所述s5中利用ypd培养基或新鲜浓缩葡萄汁对f2-p85-3菌株进行活化，活化温度为28℃，活化时间为24h。所述s6中当检测到糖浓度达到189g/l，酒精度达到6.9％，氮素浓度达到230mg/l时，进行二次发酵，发酵至泡沫回落，品温降至室温结束发酵。所述s7中利用ypd培养基对f2-b163-2菌株进行活化，活化温度为28℃，活化时间为24h。所述s8发酵过程中，每天涂布观察，确保二次接种的f2-b163-2发酵菌株正常生长，保证发酵顺利完成。所述ypd培养基的成分包括：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％，余量的蒸馏水，所述ypd培养基的ph值为自然ph值，并用高温高压立式灭菌锅对ypd培养基进行高温高压灭菌。所述高温高压灭菌的灭菌温度为121℃，灭菌压力为0.12mpa，灭菌时间为15min。所述f2-p85-3菌株的生物保藏信息为：所述jfb2菌株的生物保藏信息为：优良菌株f2-b163-2、酿酒酵母菌株f2-p85-3混合复配发酵浓缩葡萄汁高产焦糖香的评估：发酵前7天混合菌(f2-p85-3和f2-b163-2)发酵菌数浓度生长数据如图2所示，发酵前7天菌株ec1118发酵菌数浓度数据如图3所示。由图2和图3可知:混合接入菌株(f2-p85-3)、(f2-b163-2)，都第3天菌株浓度达到了最大，菌株(f2-b163-2)浓度分别为3.02x108(cfu/ml)和2.9x108(cfu/ml)，随后菌数浓度开始慢慢降低。对照组(ec1118)在第3d时菌数的浓度达到最大为3.1x108(cfu/ml)，随后菌数浓度开始慢慢降低。发酵过程中混合菌(f2-p85-3、f2-b163-2)与对照组(ec1118)消耗糖浓度的变化如图4所示。在30d内糖浓度不同的变化，混合菌发酵过程中糖浓度消耗明显要高于对照组菌株ec1118发酵过程中糖浓度消耗，而且发酵30天后，混合菌株(f2-p85-3)、(f2-b163-2)发酵酒中糖浓度为122g/l,对照菌株ec1118发酵酒中糖浓度为131g/l。发酵过程中混合菌(f2-p85-3、f2-b163-2)与对照组(ec1118)生成酒精浓度的变化如图5所示。在30d内酒精度不同的变化，混合菌发酵过程中酒精生成稍微高于对照组菌株ec1118发酵过程中酒精生成，混合菌株(f2-p85-3)和(f2-b163-2)发酵酒中酒精度为16.52％,对照菌株ec1118发酵酒中酒精度为15.82％。由混合接入菌株(f2-p85-3)和(f2-b163-2)与对照组ec1118发酵过程中糖浓度发酵图和酒精发酵图可以看出，混合接入菌株(f2-p85-3)和(f2-b163-2)糖发酵能力高于对照组ec1118糖发酵能力，故而混合接入菌株(f2-p85-3)和(f2-b163-2)发酵酒精能力自然高于对照组ec1118发酵酒精能力。混合菌(f2-p85-3、f2-b163-2)发酵酒与对照组(ec1118)发酵酒的感官评分如图6所示。混合菌(f2-p85-3、f2-b163-2)发酵酒与对照组(ec1118)发酵酒的呋喃物质浓度如图7所示。可知：f2-p85-3、f2-b163-2二种菌株发酵生成的呋喃168.31mg/l，乙酰呋喃2.25mg/l，5甲基糠醛21.43mg/l。对照组ec1118发酵生成的呋喃酮56.83mg/l，乙酰呋喃1.83mg/l，5甲基糠醛9.93mg/l。f2-p85-3、f2-b163-2二种菌株混合发酵生成的呋喃物质高于对照组ec1118发酵生成的呋喃物质。由感官评分图图6可知，f2-p85-3、f2-b163-2二种菌株混合发酵焦糖香气较对照组ec1118发酵焦糖香气更为浓郁。混合菌(f2-p85-3、f2-b163-2)发酵酒与对照组(ec1118)发酵酒5-羟甲基糠醛的降解量和残余量如图8所示。在菌株f2-p85-3、f2-b163-2混合发酵30d时，发酵酒中5-羟甲基糠醛的残余5hmf为0.15g/l，降解5-羟甲基糠醛浓度为0.66g/l，降降解率为81.4％。对照组ec1118发酵酒中5-羟甲基糠醛的残余5hmf为0.16g/l，降解5-羟甲基糠醛浓度为0.65g/l，降解率为80.2％。f2-p85-3、jfb2混合发酵和对照组ec1118相比，降解5-羟甲基糠醛幅度相差不大。高产焦糖香菌株(f2-b163-2)wl平板形态如9所示：体积大，表面粗糙，白色中透着淡绿色。感官评定菌株(f2-p85-3)wl平板形态如图10所示：体积大，表面光滑，白色奶油状。高产焦糖香菌株(f2-b163-2)耐受性分析：1、不同糖度的耐受性分析：以模拟葡萄汁为发酵基质，配置糖浓度分别为4g/l、68g/l、132g/l、196g/l、260g/l，其他成分不变，设置成4s、68s、132s、196s、260s5个处理组。每个处理组积为32ml，通过0.22um孔径的过滤膜过滤灭菌，灭菌模拟葡萄汁分别装入4个10ml灭菌离心管中，每个离心管8ml，分别接入f2-b163-2新鲜培养液，接菌量2％，28℃恒温培养，开始7天，每24小时测od值(吸光度od600nm)，观察菌株生长情况，发酵30d，利用hplc检测呋喃类物质浓度，计算生成量。发酵过程中不同糖浓度下od值变化数据如图13所示，以模拟葡萄汁为发酵基质，配制发酵基质中糖浓度分别为4g/l、68g/l、132g/l、196g/l、260g/l，通过控制模拟葡萄汁中糖浓度的不同变化，在28℃恒温发酵前7天，每天利用酶标仪检测菌株f2-b163-2的生长od值，图11可知，菌株f2-b163-2在不同糖浓度下生长能力不同，并受到培养时间影响。很明显，低糖(4g/l)最不利于菌体生长，68g/l糖度次之，低糖度明显推迟具体生长峰值。其余糖度处理在发酵期od值无明显差异，发酵第4d所有处理组od值达到最大；其中196g/l处理组中，od值最高，达到近1。发酵过程中不同糖浓度下呋喃物质生成浓度的变化如图12，上述各发酵液，28℃静止放置30d后，hplc检测呋喃物质生成量，如图12，很明显，当糖度≤196g/l，呋喃物质的生成量，随着糖度的升高而升高，直至糖浓度为196g/l时，生成的呋喃物质量达到最大(呋喃酮浓度为30.48mg/l、乙酰呋喃浓度1.088mg/l、5甲基糠醛浓度为4.78mg/l)，之后的260s，呋喃物质生成量略有减弱，但与196s无显著差异。2、不同氮素水平的耐受性分析：以模拟葡萄汁为发酵基质，配置氮素浓度分别为140mg/l、230mg/l、330mg/l、410mg/l、500mg/l，其他成分不变，设置成140n、230n、330n、410n、500n5个处理组。每个处理组体积为32ml，通过0.22um孔径的过滤膜过滤灭菌，灭菌模拟葡萄汁分别装入4个10ml灭菌离心管中，每个离心管8ml，分别接入f2-b163-2酵母菌的新鲜培养液，接菌量2％，28℃恒温培养，开始7天，每24小时测od值，观察菌株生长情况，发酵30d，利用hplc检测呋喃类物质浓度，不同n素浓度下od值变化如图13所示以模拟葡萄汁为发酵基质，配制发酵基质中不同氮素浓度为140mg/l、230mg/l、330mg/l、410mg/l、500mg/l，接入f2-b163-2菌，在28℃恒温发酵，前7天，每天利用酶标仪检测菌株其od值，低氮素水平n140和n230处理组中菌体od值变化相近，生长峰值；中氮素水平n330和n410处理组od值变化相近，高氮素水平的处理组n500od值总体略低于其他处理组，说明高氮素水平具体有略微一致作用。所有处理组，第3d达到生长峰值，其中n140高于其他处理组。发酵过程中不同n素浓度下呋喃物质生成浓度的变化如图14所示。3、不同酒精量的耐受性分析：以模拟葡萄汁为发酵基质，分别配置8％、10％、12％、14％、16％的酒精浓度，其他成分不变，设置成8a、10a、12a、14a、16a5个处理组。每个处理体积为32ml，通过0.22um孔径的过滤膜过滤灭菌，灭菌模拟葡萄汁分别装入4个10ml灭菌离心管中，每个离心管8ml，分别接入f2-b163-2酵母菌的新鲜培养液，接菌量2％，28℃恒温培养，开始7天，每24小时测od值，观察菌株生长情况，发酵30d，利用hplc检测呋喃类物质浓度，计算生成量。发酵过程中不同酒精浓度下od值变化，如图15所示。发酵过程中不同酒精浓度下呋喃物质生成浓度的变化如图16所示。上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所述
技术领域：
的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。当前第1页12