抗SARS-CoV-2感染的蛋白以及用该蛋白制备的疫苗的制作方法

抗sars
‑
cov
‑
2感染的蛋白以及用该蛋白制备的疫苗
技术领域
1.本发明涉及抗sars
‑
cov
‑
2感染的蛋白以及用该蛋白制备的疫苗，属于医药领域。


背景技术：

2.sars
‑
cov
‑
2是由世界卫生组织而命名的一种新型的β属的冠状病毒。该病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60
‑
140nm。其基因特征与sars
‑
cov和mers
‑
cov有明显区别，是一种以前尚未在人类中发现的新冠状病毒分支。蝙蝠可能是sars
‑
cov
‑
2的天然宿主，此外，有研究认为穿山甲也可能是该病毒的动物来源。目前，新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2已导致数万人感染，还没有确切有效的抗病毒药物能够进行预防与治疗，开发针对该病毒的疫苗对于疾病的防治非常重要。


技术实现要素：

3.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供抗sars
‑
cov
‑
2感染的蛋白。本发明的另一目的在于提供含有所述蛋白的用于预防和/或治疗sars
‑
cov
‑
2感染的疫苗。
4.本发明提供了抗sars
‑
cov
‑
2感染的蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示，或者与seq id no.1具有99％以上的同源性且具有相同或相似的生物学活性。
5.seq id no.1：
6.vnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrar
7.sars
‑
cov
‑
2病毒s蛋白的胞外段构成如图6所示，sp，信号肽；ntd，n
‑
端结构域；rbd，受体结构域；fp，融合肽；ifp，內融合肽；hr1，七肽重复区1；hr2，七肽重复区2；ptm，近膜区；tm，跨膜区。上述seq id no.1是基于s蛋白val16
‑
arg685氨基酸来设计的抗sars
‑
cov
‑
2感染药物。
8.本发明提供了所述蛋白的前体，该前体在所述抗sars
‑
cov
‑
2感染的蛋白上连接了信号肽和/或蛋白标签。
9.优选地，所述的蛋白标签选自如下至少一种：组氨酸标签、硫氧还蛋白标签、谷胱甘肽转移酶标签、泛素样修饰蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、c
‑
myc蛋白标签、avi tag蛋白标签、氮源利用物质a蛋白标签。
10.进一步地，所述的前体在所述抗sars
‑
cov
‑
2感染的蛋白上还连接了切除蛋白标签的蛋白酶识别区。
11.优选地，所述的蛋白酶选自如下至少一种：肠激酶、tev蛋白酶、凝血酶、凝血因子xa、羧肽酶a、鼻病毒3c蛋白酶。
12.本发明提供了所述的蛋白和/或所述的前体在制备预防和/或治疗sars
‑
cov
‑
2感染的药物中的用途。
13.本发明提供了预防和/或治疗sars
‑
cov
‑
2感染的疫苗，它含有所述的蛋白和/或所述的前体，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。
14.进一步地，所述的辅助性成分为免疫佐剂。
15.优选地，所述的免疫佐剂选自如下至少一种：铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质a(mpl)、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、鲨烯水包油乳剂(mf59)、重组霍乱毒素(rctb)、gm
‑
csf细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料、cpg odn(含有非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心序列的核苷酸序列，人工合成的cpg)。
16.进一步地，所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种。
17.其中，所述的免疫佐剂优选为氢氧化铝佐剂；所述抗sars
‑
cov
‑
2感染的蛋白：氢氧化铝佐剂的配比优选为(32～48)mcg/ml：(0.8～1.2)mg/ml，佐剂以氢氧化铝的含量计；进一步优选地，所述抗sars
‑
cov
‑
2感染的蛋白：氢氧化铝佐剂的配比优选为40mcg/ml：1.0mg/ml，佐剂以氢氧化铝的含量计。
18.进一步地，所述的钙盐为磷酸三钙。
19.进一步地，所述的植物皂苷为qs
–
21或iscom。
20.进一步地，所述的植物多糖为黄芷多糖(aps)。
21.进一步地，所述的脂质选自如下至少一种：磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰胆碱(pc)、胆固醇(chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)。
22.进一步地，所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种：(2,3
‑
二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)、n
‑
[1
‑
(2,3
‑
二油酰氯)丙基]
‑
n,n,n
‑
氯化三甲胺(dotma)、阳离子胆固醇(dc
‑
chol)、三氟乙酸二甲基
‑
2,3
‑
二油烯氧基丙基
‑2‑
(2
‑
精胺甲酰氨基)乙基铵(dospa)、溴化三甲基十二烷基铵(dtab)、溴化三甲基十四烷基铵(ttab)、溴化三甲基十六烷基铵(ctab)、溴化二甲基双十八烷基铵(ddab)。
[0023]
进一步地，所述的疫苗为注射制剂。
[0024]
优选地，所述的疫苗为肌肉注射制剂。
[0025]
本发明提供了多核苷酸，它编码所述的蛋白或所述的前体。
[0026]
进一步地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.3所示。seq id no.2：
[0027]
gttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgca
cttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctcggcgggcacgt
[0028]
上述seq id no.2为编码val16
‑
arg685的原始核酸序列，根据第一株全基因组测序的新冠wuhan
‑
hu
‑
1分离毒株的序列得到。
[0029]
seq id no.3：
[0030]
gtgaacctgaccaccaggactcagctgcctcccgcctacaccaactccttcactcgcggtgtgtactaccctgacaaggtcttccgttccagcgtgctgcactctactcaggacctgttcctgcccttcttctctaacgtcacctggttccacgccatccacgtgtccggtaccaacggcactaagcgcttcgacaacccagtgctgcctttcaacgacggagtctacttcgctagcaccgagaagtctaacatcatccgtggatggatcttcggtaccactctggactcaaagactcagtccctgctgatcgtcaacaacgccaccaacgtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttctgcaacgacccattcctgggcgtctactaccacaagaacaacaagagctggatggagtctgagttccgcgtctactcttcagctaacaactgcactttcgagtacgtgtcacagcctttcctgatggacctggaaggaaagcagggtaacttcaagaacctgagggagttcgtgttcaagaacatcgacggttacttcaagatctactcaaagcacaccccaatcaacctggtgcgcgacctgcctcagggattctccgctctggagccactggtggacctgcctatcggtatcaacatcacccgcttccagactctgctggctctgcaccgtagctacctgactcctggcgactcttcttctggatggactgctggagctgctgcttactacgtgggttacctgcagcctaggaccttcctgctgaagtacaacgaaaacggcaccatcactgacgccgtcgactgcgctctggaccctctgagcgaaaccaagtgcactctgaagtctttcaccgtggagaagggtatctaccagactagcaacttcagggtgcagcccaccgaatctatcgtcagattccctaacatcactaacctgtgccccttcggcgaggtcttcaacgccaccagattcgcttccgtgtacgcctggaacaggaagagaatcagcaactgcgtcgctgactactctgtgctgtacaacagcgcctctttctcaaccttcaagtgctacggtgtgagcccaactaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtctacgccg
actctttcgtgatcaggggcgacgaggtcagacagatcgctcctggccagactggaaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggttgcgtcatcgcttggaactcaaacaacctggactccaaagtgggtggcaactacaactacctgtaccgcctgttccgtaagtcaaacctgaagccattcgagagggacatctcaactgaaatctaccaggctggctccaccccttgcaacggtgtcgagggcttcaactgctacttccccctgcagtcctacggattccagccaactaacggtgtgggctaccagccttacagagtggtcgtgctgtcattcgaactgctccacgctcctgctactgtgtgcggaccaaagaagtccaccaacctggtcaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggtctgaccggaactggtgtcctgaccgagtcaaacaagaagttcctgcccttccagcagttcggcagggacatcgctgacaccactgacgctgtgcgcgaccctcagaccctggaaatcctggacatcactccatgcagcttcggaggtgtctctgtgatcactccaggaaccaacacttccaaccaggtcgctgtgctgtaccaggacgtcaactgcaccgaggtccctgtggccatccacgctgaccagctgacccccacttggcgcgtgtactctaccggctcaaacgtcttccagactcgtgctggttgcctgatcggcgccgagcacgtgaacaactcatacgaatgcgacatccccatcggcgctggaatctgcgcctcctaccagacccagactaactcaccacgcagggctagg
[0031]
上述seq id no.3是发明人对昆虫细胞作密码子优化后得到的编码val16
‑
arg685的核酸序列。
[0032]
本发明提供了重组载体，它含有所述多核苷酸。
[0033]
进一步地，所述的重组载体采用昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种。
[0034]
优选地，所述的昆虫杆状病毒表达载体为pfastbac1。
[0035]
优选地，所述的大肠杆菌表达载体为pet32a。
[0036]
优选地，所述的酵母表达载体为ppiczaa。
[0037]
优选地，所述的哺乳动物细胞表达载体为cho细胞表达载体。
[0038]
进一步优选地，所述的cho细胞表达载体为ptt5或ftp
‑
002。
[0039]
本发明提供了宿主细胞，它含有所述的重组载体。
[0040]
进一步地，所述的宿主细胞采用昆虫细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母中至少一种。
[0041]
优选地，所述的昆虫细胞选自sf9细胞、sf21细胞、hi5细胞中至少一种。
[0042]
优选地，所述的哺乳动物细胞为cho细胞。
[0043]
本发明提供了所述蛋白的制备方法，包括如下步骤：培养所述的宿主细胞，使其表达所述的蛋白或前体，然后回收所述的蛋白，即得。
[0044]
本发明提供了所述蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建含有所述多核苷酸的重组载体，对人体进行免疫，产生所述的蛋白。
[0045]
进一步地，所述的载体选自如下至少一种：mrna、dna疫苗、腺病毒、安卡拉痘苗病毒vaccinia ankara virus、腺相关病毒。
[0046]
本发明提供了抗sars
‑
cov
‑
2感染的蛋白及疫苗，能够诱导体内产生抗体等免疫反应，阻断sars
‑
cov
‑
2的s蛋白与宿主细胞ace2受体的结合，从而帮助宿主抵抗冠状病毒感染。动物实验证明，本发明制备的蛋白安全性好，无明显毒副作用，对sars
‑
cov
‑
2感染能够发挥显著的防治作用，具有广阔应用前景。
附图说明
[0047]
图1为试验例1中小鼠血清的a450吸光度值测量结果图；
[0048]
图2为试验例2中免疫血清体外阻断s1蛋白与ace2结合图；
[0049]
图3为试验例3中免疫血清病毒中和抗体滴度测定结果图；
[0050]
图4为试验例4中攻毒小鼠肺病毒拷贝数测定结果图；
[0051]
图5为试验例4中攻毒小鼠肺病理he染色图；
[0052]
图6为sars
‑
cov
‑
2病毒s蛋白的胞外段构成示意图。
具体实施方式
[0053]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0054]
实施例1用昆虫杆状病毒表达系统制备本发明抗sars
‑
cov
‑
2感染的蛋白
[0055]
载体构建：采用如seq id no.3所示的核苷酸序列。基于pfastbac1载体(氨苄抗性)构建s蛋白胞外段val16
‑
arg685的表达载体，使用bamhi，hindiii酶切位点插入到pfast
‑
baci载体中，按昆虫细胞偏爱密码子优化。
[0056]
重组杆状病毒的扩增：采用bac
‑
to
‑
bac表达系统，利用细菌转座子原理，通过tn7转座元件产生位点特异性转座，在大肠杆菌(dh10bac，含bacmid(卡那霉素抗性)和helper plasmid(四环霉素抗性))内完成重组bacmid的构建。提取重组成功的bacmid，用cellfectin ii将其转染至sf9昆虫细胞以产生可表达目的基因的重组杆状病毒。转染72h后收取第一代病毒，然后进行p2到p4代病毒的扩增，利用p3或p4代病毒表达蛋白。
[0057]
蛋白表达：利用p3或p4代病毒感染hi5昆虫细胞(也可用sf9和sf21细胞)，感染复数(moi为0.5
‑
10)，培养48
‑
72h后收集上清。最佳收获时间根据毒种病毒量和细胞状态可能每次都有差异，一般以镜检50％左右细胞病变为宜。
[0058]
蛋白纯化：收获的培养上清4℃高速离心，0.22um滤膜过滤，采用亲合纯化方法(histrap镍柱)初步纯化重组蛋白，然后利用monoq离子柱和superdex 200 10/300gl分子筛精纯重组蛋白，sds
‑
page鉴定蛋白纯度，纯度要求达到95％以上。最终所得重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，可用于动物免疫等后续研究。
[0059]
实施例2本发明抗sars
‑
cov
‑
2感染的疫苗的制备
[0060]
在无菌条件下进行抗原配制。以5mmol/l磷酸缓冲液(ph7.2)稀释纯化后的重组蛋白抗原(实施例1制备)至浓度为80mcg/ml。在无菌条件下配制佐剂，5mmol/l磷酸缓冲液(ph7.2)稀释氢氧化铝佐剂原液(氢氧化铝含量是14.55mg/ml)至浓度为2.0mg/ml。在无菌条件下进行抗原
‑
佐剂吸附，按照20ml/min的速度，将稀释后的蛋白抗原液体滴加至稀释后的氢氧化铝佐剂工作液中，体积比为(v/v)1：1，使混合液中重组蛋白抗原终浓度为40mcg/ml，铝佐剂终浓度为1.0mg/ml。保持反应温度为25℃，搅拌速度为800rpm。滴加完成后继续保持25℃、800rpm搅拌吸附60min。调节混合后溶液ph至7.2。4℃避光保存。对吸附后的疫苗制剂进行表征，包括粒径、点位、抗原含量、佐剂含量、吸附率、ph值、内毒素、佐剂
‑
抗原吸附率、吸附强度及其保持状态、吸附后抗原完整性和稳定性等。灌装。将检测合格的疫苗制剂
灌装如1ml无菌西林/安瓿瓶中，1ml/瓶。灌装时应不停搅拌，使灌装液均匀。罐装后立即封盖，贴上编号标签，4℃避光保存。
[0061]
以下通过生物实验证明本发明的有益效果。
[0062]
试验例1在接种过本发明疫苗的小鼠体内诱导出s蛋白胞外段val16
‑
arg685(简称为s1)的特异性抗体
[0063]
免疫动物实验：使用balb/c小鼠或c57bl/6小鼠，分组如图1所示，每组5到10只小鼠。所用的重组蛋白胞外段aa16
‑
685氨基酸序列如seq id no.1所示，剂量为1.0μg到20.0μg/只不等，具体剂量见图1。实验组小鼠每只注射疫苗(根据实施例2制备)的容积为50μl，在小鼠右后腿肌肉注射(im)，以第1、7与21天(共免疫3次)的免疫程序免疫小鼠。
[0064]
elisa(酶联免疫吸附试验)测定小鼠血清抗体：在小鼠免疫程序结束后的第7天(首次免疫后第28天)，用毛细管眼眶采血法收集小鼠血浆，每组6只。室温放置1
‑
2h，凝固后于4℃，3000rpm离心10min后，取上层血清保存于
‑
20℃备用。
[0065]
50mm碳酸盐包被缓冲液(ph9.6)的配制：称取0.293g nahco3和0.15g na2co3，用双蒸水溶解后，调节ph到9.6，然后定容至100ml，保存于4℃备用。
[0066]
1m h2so4终止液的配制：向47.3ml双蒸水中逐滴加入2.7ml的浓硫酸(98％)。
[0067]
elisa测定血清igg的方法：用50mm碳酸盐包被缓冲液配制1μg/ml的重组蛋白s1溶液，按照100μl/孔加入到96孔包被板中(thermo scientific公司，nunc
‑
maxisorp)，4℃包被过夜。次日用含0.1％tween20的pbs溶液(pbst)洗涤3次后，用含1％bsa或者5％脱脂牛奶的封闭液(配制在pbst中)室温封闭1h后，pbst洗涤1次。将小鼠血清用封闭液稀释成不同比例后，按照100μl/孔的上样量上样，37℃孵育1h
‑
2h(或4℃过夜)，然后用pbst洗涤3次。然后按照100μl/孔加入hrp
‑
山羊抗鼠igg抗体(1:5000稀释于封闭液中)，37℃孵育1h后，pbst洗涤5次。最后加入100μl/孔3,3',5,5'
‑
四甲基联苯二胺(tmb)，避光显色10
‑
15min后，加入50μl/孔1m h2so4终止液，并不停搅拌混匀。在酶标仪上450nm波长处读数。
[0068]
将血清连续不同倍数稀释后用滴定法测量a450吸光度值，以测定重组蛋白诱导的s1特异性抗体的滴度。以450nm吸光度值为纵坐标，以稀释倍数为横坐标作图。如从图1可以看出，接种生理盐水的对照组和接种氢氧化铝佐剂的对照组的a450光密度值较低，其他接种蛋白组的a450光密度值较对照组都有显著升高，证明本发明重组蛋白激发了明显的s1特异性抗体。进一步地，氢氧化铝佐剂显著提高了蛋白疫苗的抗体滴度，且呈重组蛋白剂量依赖关系。以上结果表明，重组s1蛋白疫苗在小鼠体内具有高度的免疫原性。
[0069]
试验例2本发明s1蛋白与ace2受体结合的阻断实验
[0070]
本实验使用了细胞表达的ace2，该蛋白被认为可以保留天然构象，以便用流式细胞仪检测s1结合活性。具体操作如下：
[0071]
消化并收集体外培养的高表达ace2细胞株(肺癌a549)到流式管中，106个细胞/管，用pbs/hbss洗涤数次。向每管细胞中加入终浓度1μg/ml的重组s1
‑
fc蛋白；再加入免疫的抗s1小鼠的血清(将试验例1中10μg/只剂量免疫获得的小鼠血清稀释50倍)，室温孵育30min。其中阳性对照管不加抗血清，生理盐水管加入试验例1中未免疫小鼠的正常血清。用pbs/hbss洗涤数次后再加入anti
‑
human igg(fc specific)
‑
fitc(sigma)荧光二抗(1:100
‑
1:200),室温避光孵育30min。用pbs/hbss洗涤数次后，加入500μl含1％多聚甲醛的pbs固定后，流式上机检测。
[0072]
结果如图2所示，加入s1
‑
fc蛋白可与表达ace2的细胞结合，阳性对照组阳性细胞百分比大于80％；未添加s1
‑
fc蛋白则仅检测到背景信号(阴性对照)；小鼠抗血清有效地阻断了s1
‑
fc蛋白与表达ace2的细胞的结合，阳性细胞百分比小于25％；而相同稀释度的未免疫或免疫前的血清则没有表现出阻断作用，阳性细胞百分比大于80％。
[0073]
试验例3s1蛋白免疫血清的假病毒中和实验
[0074]
将待检测的免疫血清(或血浆)于56℃水浴灭活30min，6000g离心3min，将上清转移至1.5ml离心管中待用。
[0075]
取96孔板，于第2列(细胞对照cc，见表1)加入dmem完全培养基(1％双抗，25mm hepes，10％fbs)150μl/孔，于第3～11列(第3列为病毒对照vc，第4～11列为样品孔)加入dmem完全培养基100μl/孔，于b4～b11孔中再加入dmem完全培养基42.5μl/孔。
[0076]
表1
[0077][0078]
于b4和b5孔加入血浆样品1(7.5μl)
……
以此类推，于b10和b11孔加入血浆样品4(7.5μl)。
[0079]
将多道移液器调至50μl，对b4～b11孔中液体轻柔的反复吹吸6～8次充分混匀，然后转移50μl液体至对应的c4～c11孔，轻柔的反复吹吸6～8次后转移至d4～d11孔，以此类推，最后从g4～g11中吸弃50μl液体，加样顺序参照表1。
[0080]
用dmem完全培养基将假病毒稀释至1.3
×
104(1
×
104～2
×
104)tcid50/ml(按提供的稀释倍数稀释)，于第3～11列每孔加50μl，使每孔含假病毒的量为650(500
‑
1000)/孔。本实验使用的假病毒由中国食品药品检定研究院提供，是基于水疱性口炎病毒(vsv)的假病毒检测系统，表达全长s蛋白，该假病毒以与活病毒相同的方式进入细胞，可用于sars
‑
cov
‑
2中和抗体的检测和定量分析。
[0081]
将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％co2)孵育1小时。
[0082]
当孵育时间至半小时，取出培养箱中事先准备好的hace2
‑
293t细胞(汇合率达80％～90％)，以t75培养瓶为例，吸弃瓶中的培养基，加入5ml pbs缓冲液清洗细胞，倾去pbs后，加入3ml 0.25％胰酶
‑
edta，使其浸没细胞消化1分钟，倾去胰酶，置于细胞培养箱中消化5分钟，轻轻拍打培养瓶侧壁使细胞脱落，加入10ml培养基中和胰酶，吹打几次后转移至离心管中，210g离心5分钟，倾去上清，用10ml dmem完全培养基重悬细胞，细胞计数，用dmem完全培养基将细胞稀释至2
×
105个/ml。
[0083]
孵育至1小时，向96孔板中每孔加100μl细胞，使每孔细胞为2
×
104个。
[0084]
将96孔板前后左右轻轻晃动，使细胞在孔中分散均匀，将96孔板放入细胞培养箱
中，37℃，5％co2培养20～28小时。
[0085]
20～28小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃150μl上清，然后加入100μl荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min。
[0086]
反应结束后，用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸6～8次，使细胞充分裂解，从每孔中吸出150μl液体，加于对应96孔化学发光检测板中，置于化学发光检测仪中读取发光值。
[0087]
计算中和抑制率：抑制率＝[1－(样品组的发光强度均值－空白对照cc均值)/(阴性组的发光强度vc均值－空白对照值cc均值)]
×
100％。
[0088]
根据中和抑制率结果，利用reed
‑
muench法计算ic50。
[0089]
分别统计注射生理盐水和s1疫苗小鼠血清中和抗体ec50滴度，结果如图3所示，注射生理盐水的小鼠血清中仅检测到极低的ec50中和抗体滴度，而在免疫s1疫苗的小鼠血清中检测出较高的ec50中和抗体滴度。
[0090]
试验例4小鼠sars
‑
cov
‑
2病毒感染攻毒试验
[0091]
小鼠免疫，6至8周龄的hace2转基因c57bl/6小鼠，以每只10μg剂量肌肉注射重组s1蛋白疫苗(根据实施例2制备)。比如，小鼠在第1、14、21天受一次疫苗注射，对照组小鼠注射氢氧化铝免疫佐剂或仅生理盐水。在免疫后的7天后再次收集血清。在免疫后的7天，sars
‑
cov
‑
2病毒攻击(经鼻内感染，剂量为105tcid50)。此外，对照组小鼠注射氢氧化铝免疫佐剂或仅生理盐水感染该病毒的小鼠作为对照。病毒攻击5天后处死小鼠，切取小鼠的肺和其他器官。肺组织用于检测病毒复制。用powerup sybg green master mix试剂盒(applied biosystems,usa)进行实时定量逆转录聚合酶链反应(qrt
‑
pcr)反应，测定受sars
‑
cov
‑
2攻击的小鼠肺组织中的病毒rna拷贝数，并以肺组织的rna拷贝数/ml表示。用于qrt
‑
pcr的引物序列为针对sars
‑
cov
‑
2的包膜(e)基因，如下：
[0092]
前向：5
’‑
tcgtttcggaagagacaggt
‑3’
(seq id no.4)；
[0093]
反向：5
’‑
gcgcagtaaggatggctagt
‑3’
(seq id no.5)。
[0094]
本实验测试了疫苗接种是否能够阻止小鼠受sars
‑
cov
‑
2病毒感染。用sars
‑
cov
‑
2病毒攻击人ace
‑
2转基因小鼠，并于病毒攻击后5天收集小鼠肺组织，测量其接受疫苗或对照的病毒复制情况。如图4所示，用本发明蛋白疫苗免疫小鼠后，定量实时逆转录聚合酶链反应(qrt
‑
pcr)检测到很少量病毒复制，而对照组小鼠肺组织中病毒复制水平较高。
[0095]
收集部分肺组织并用10％中性福尔马林固定，包埋于石蜡中，切片厚度5μm，并使用苏木精和伊红(he)染色。光镜观察组织病理学变化。如图5所示，对照组(生理盐水组合氢氧化铝组)小鼠肺组织出现明显的间质性肺炎组织病理学变化，包括肺泡壁明显增厚，充血、间质大量单个核细胞浸润。与此形成对照的是，重组s1蛋白疫苗免疫小鼠未见组织病理学改变。
[0096]
以上实验结果进一步证实本发明s1蛋白疫苗可以阻断sars
‑
cov
‑
2病毒的感染。
[0097]
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。