一种促进A型流感病毒复制的宿主蛋白及其应用

本发明属于分子生物学与免疫学领域，具体涉及宿主蛋白免疫球蛋白样受体ildr1促进流感病毒np蛋白的表达以及在流感病毒增殖中的应用。

背景技术：

a型流感病毒曾经造成人类历史上数次大流感的暴发，成为严重威胁人类健康的主要病毒之一，其防治对于公共卫生安全具有重要的意义。由于流感病毒属于单股负链分节段的rna病毒，可以通过高突变率与基因重排不断产生新型病毒，使得目前疫苗免疫和以流感病毒蛋白作为药物靶标的药物研发相对滞后。针对病毒靶点药物的大量使用进一步加速了流感耐药株的出现。因此,新型作用机制抗流感药物的研发尤为迫切。

流感病毒的生活周期包括病毒的吸附、穿入、脱衣、mrna的合成、蛋白质的合成、vrna的复制、病毒颗粒的组装和释放。复制周期的各个阶段均需要宿主蛋白的帮助。与病毒蛋白相比,参与病毒复制的宿主因子相对不易产生变异,而且病毒复制所必须的一些宿主因子对宿主细胞并非至关重要。

a型流感病毒核糖核蛋白（vrnp）复合物是病毒rna转录和复制的结构基础，在病毒感染细胞的过程中发挥重要作用。病毒感染早期，vrnp复合物经内吞作用、脱膜后被释放到宿主细胞的胞质中，并在核定位信号和转运蛋白的作用下进入胞核，促进病毒转录和复制。vrnp包括rna依赖性rna聚合酶复合物（rdrp）和核蛋白（np蛋白），其中np蛋白是流感病毒的特异性功能蛋白，可以作为特异性阻断流感病毒复制的靶标。目前发现其入核受到宿主蛋白调控，并且报道了调控其入核的一系列宿主蛋白。如α-actinin-4，crm1、uap56，hsp40和mov10等，在促进或抑制病毒的复制过程中发挥着重要的作用。发现新的相互作用蛋白将有助于对流感病毒的防控提供新的靶标。

技术实现要素：

针对流感病毒变异容易导致疫苗防护效果下降和失效等问题，本发明提供一种新的蛋白可作用于流感病毒增殖，该蛋白源于宿主，能够与a型流感病毒互作，能够促进其增殖。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种促进a型流感病毒复制的宿主蛋白，其氨基酸序列如seqidno:1所示。

一种上述宿主蛋白的核苷酸序列。优选的，宿主蛋白的核苷酸序列如seqidno:2所示。

一种包含上述宿主蛋白核酸序列的重组载体、工程菌和细胞系。所述重组载体选自质粒。所述工程菌选自大肠杆菌。所述细胞系选自cos7细胞系，hek293t细胞系，a549细胞系，mdck细胞系。

一种上述宿主蛋白在增殖a型流感病毒株中的应用。

一种上述宿主蛋白的干扰rna。所述干扰rna是双链sirna，其序列如seqidno:3或seqidno:4所示。

一种上述sirna作为制备预防和治疗a型流感药物的应用。

本发明具有以下优点：

本发明提供的宿主蛋白可以调控a型流感病毒复制，可以用于科研过程中提高病毒扩增量，还可以以其为靶标用于a型流感药物研发，在新药研发方面具有重要意义。本发明提供的干扰rna可以显著降低促进a型流感病毒复制的宿主蛋白的表达量，从而显著抑制流感病毒的复制。

附图说明

图1为小鼠感染h1n1病毒后ildr1不同时间的表达差异；

图2为h1n1病毒感染hek293t细胞后ildr1的表达量变化；

图3为免疫荧光检测ildr1-gfp在cos7细胞中的定位；

图4为ildr1-gfp在cos7细胞中表达蛋白的westernblot；

图5为过表达ildr1后h1n1病毒的表达量；

图6为敲低ildr1后h1n1病毒的表达量；

图7为过表达ildr1后h9n2病毒的表达量；

图8为敲低ildr1后h9n2病毒的表达量。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1ildr1基因的获得

将h1n1毒株（分离自山东青岛某一发病猪场）感染42日龄c57bl/6j小鼠并采集感染不同时间点实验组及对照组的肺脏，进行高通量测序。通过生物信息学分析发现：与对照组相比较，ildr1的表达量显著升高。紧接着分别在感染0、1、3、5、7、14天后，取肺脏提取总蛋白，进行westernblot检测，结果发现，ildr1水平在感染后的第一天就显着增加了15倍以上，随着病毒载量的降低，在7天表达量开始降低，14天时基本恢复正常水平（图1）。

利用不同moi的h1n1siv（moi=0,0.01,0.1,1,10）感染hek293t细胞，于感染后24h后收集细胞，利用qrt-pcr检测ildr1的表达变化（图2a）。同样，利用moi=1的h1n1siv，感染hek293t细胞，于感染后0h,6h,12h,24h,48h,72h收集细胞，利用qrt-pcr检测ildr1的表达变化（图2b）。结果表明，siv感染后ildr1mrna的表达以剂量和时间依赖的方式显着增加。

参照ncbi网站上的小鼠基因组参考序列，并根据转录组拼接序列，设计小鼠ildr1基因全长cds区克隆引物，上下游引物分别引入ecor1和sal1酶切位点（下划线），序列如下：

以小鼠肺脏组织cdna为模板，进行pcr扩增，扩增体系如下：

扩增反应如下：

扩增得到1600bp左右的产物，经胶回收后连接到pegpfn2质粒上，阳性质粒（ildr1-gfp质粒）进行测序，目的基因序列如seqidno:2所示，共编码538个氨基酸，氨基酸序列如seqidno:1所示。

实施例2ildr1蛋白的表达

将实施例1中获得的ildr1-gfp质粒、未连接目的基因的pegpfn2空载体质粒，分别利用lip2000脂质体转染cos7细胞系，同时将只加入转染试剂、未加入任何质粒的处理组也设为阴性对照组。转染24h后显微镜下观察绿色荧光，确定转染效率。结果如图3所示，ildr1-gfp的转染效率达50%以上。将以上转染有ildr1-gfp和pegpfn2载体的细胞，于co2培养箱中培养24h，提取细胞的总蛋白，利用anti-gfp标签抗体进行westernblot检测，结果如图4所示，ildr1-gfp可以在cos7细胞中有效高表达。

实施例3ildr1蛋白量调控对a型流感病毒增殖的影响

1.过表达ildr1促进流感病毒的复制

将生长状态良好的hek293t细胞以2×10⁵个/ml的密度接种于6孔板中，第二天转染ildr1-gfp和pegpfn2载体，24h后感染moi=0.1的病毒，于接毒24h后收集细胞上清液，进行tcid50和病毒rna检测。结果如图5所示：与阴性对照组相比，过表达ildr1后，流感病毒的表达量升高。

2.敲低ildr1抑制流感病毒的复制

根据si-rna设计的一般原则，设计sirna靶点，合成以下序列：

将上述si-ildr1和nc转染hek293t细胞，于co2培养箱中培养48h后，提取总rna，利用q-pcr进行敲除效率的检测。结果显示：两对si-rna均可以敲低ildr1在50%以上。

将生长状态良好的hek293t细胞以2×10⁵个/ml的密度接种于6孔板中，第二天转染si-ildr1和nc，24h后感染moi=0.1的病毒，于接毒48h后收集细胞上清液，病毒rna检测。结果如图6所示：与阴性对照组(nc组)相比，敲低ildr1后，能够抑制流感病毒的复制。

实施例4ildr1蛋白量调控对h9n2流感病毒增殖的影响

参照实施例3中的方法，将生长状态良好的hek293t细胞，转染ildr1-gfp和pegpfn2载体，24h后感染moi=0.1的h9n2病毒，于接毒24h后收集细胞上清液，进行病毒rna检测。结果如图7所示：与阴性对照组相比，过表达ildr1后，h9n2流感病毒的表达量明显升高达6倍以上。转染si-ildr1和nc24h后感染moi=0.1的病毒，于接毒48h后收集细胞上清液，病毒rna检测。结果如图8所示：与阴性对照组(nc组)相比，敲低ildr1后，能够明显抑制h9n2流感病毒的复制。

序列表

<110>山东省农业科学院家禽研究所

<120>一种促进a型流感病毒复制的宿主蛋白及其应用

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