一种简便快速的红曲霉分离保存方法与流程

本发明属于微生物分离技术领域，具体涉及一种简便快速的红曲霉分离保存方法。

背景技术：

红曲霉是一种药食两用微生物，在生长过程中能产生多种生物酶，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等，还能产生有益物质，如洛伐他汀、γ-氨基丁酸、麦角固醇等，红曲霉在白酒行业中也广泛应用，红曲霉主要存在于酒曲和酒醅中，由于白酒的发酵是一个开放的过程，酒曲和酒醅中存在着大量的微生物，如根霉、青霉、毛霉、黄曲霉、酵母菌、乳酸菌等等，且红曲霉在其中数量较少，不占据优势。

使用常规稀释涂布法进行分离，即将酒曲或酒醅样品制成菌悬液，之后进行10倍递增稀释，再分别取不同稀释度的菌液少许，于平板中涂布培养。稀释梯度低时根霉、青霉等常常占据优势，生长覆盖整个平板，红曲霉无法占据生长空间，或无法挑选出红曲霉进行分离纯化；稀释梯度高时，由于红曲霉的数量较少，稀释后长出红曲霉的数量较少或很难生长出。

使用乳酸或乙醇优化培养基，或红曲米中红曲霉为主要优势菌，使用稀释涂布法，可以分离出红曲霉，但需要大量的稀释、涂布、划线等操作，实验工作量大、试剂耗费大、分离周期长，一般约需要两到三个红曲霉生长周期14-21d。

有学者使用孔板技术分离培养红曲霉，以节约试剂，提高效率，例如中国发明专利申请cn109593660a，但是这类技术方案中由于红曲霉是霉菌，霉菌生长时间久，菌落形态较大，孔板的面积太小，不利于红曲霉的分离和菌落形态的观察，且各孔板间易相互污染。

亦有学者使用真菌抑制剂培养法进行分离，即在分离纯化培养基中加入了脱氧胆酸钠以抑制真菌菌丝体的蔓延，但该抑制剂同样也会抑制红曲霉的生长，使红曲霉难以分离出。

因此，如何有效抑制样品中其他微生物的生长，且能够在短时间内快速有效分离得到红曲霉，是目前亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的是针对含有丰富微生物样品的分离红曲霉现有技术不足，提供一种简易快速的红曲霉分离方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种简便快速的红曲霉分离保存方法，由以下步骤组成：

s1：称取待分离样品；

s2：将待分离样品均匀的平铺于已凝固的土豆汁葡萄糖琼脂培养基上，直接滴加一定浓度的乳酸溶液，使其湿润覆盖平板中待分离的样品；

s3：30℃进行培养，不断观察及时挑选培养基上的灰白色至橙红色菌落，于新的pda培养基上进行划线分离，纯化出的单菌落挑取小块长有红曲霉的培养基，纯化后的红曲霉菌株于甘油管中进行低温保藏。

优选地，s1中分离样品为0.1～0.2g的酒曲或红曲米粉，或者1～2g的酒醅。

优选地，s2中培养基的具体配置方法为：200g马铃薯削皮切成小块，加水煮沸20min，过滤后，加入20g葡萄糖，15g琼脂粉，以蒸馏水定容至1000ml，115℃灭菌20min。

优选地，s2中采用浓度为50％的乳酸溶液，具体配置方法为：量取50ml的纯乳酸、50ml的蒸馏水，于锥形瓶中混合均匀，于121℃灭菌20min。

优选地，s3中纯化后的红曲霉菌株于甘油管中进行低温保藏的具体步骤为：挑取小块长有红曲霉的培养基，放入装有浓度为30％的甘油溶液的甘油管中，在-20℃条件下静置24小时，然后置于-80℃的环境中保藏。

本发明的有益效果如下：

(1)对待分离样品的需求量较少，且种类不限，即使对微生物丰富的酒曲样品也有很好的分离效果。

(2)实验使用均为常用实验器材，操作过程简易，操作工作量少，且分离效率高，分离周期只需要7-10d，是常规分离手段周期的一半。

(3)利用红曲霉嗜乳酸的特点，滴加较高浓度乳酸，抑制其他微生物的生长；利用固态平板作为培养基，便于对不同形态的菌落进行挑取分离。

(4)采用甘油管低温静置后，再至于-80℃保藏，有助于菌株的预冷冻和保藏，保藏时间可达5-10年，保存质量好。

附图说明

图1(a)为本发明利用纯乳酸分离酒曲样品的效果图；

图1(b)为本发明利用浓度为50％的乳酸溶液分离酒曲样品的效果图；

图1(c)为本发明利用浓度为25％的乳酸溶液分离酒曲样品的效果图；

图1(d)为本发明利用浓度为12.5％的乳酸溶液分离酒曲样品的效果图；

图2为本发明分离得到的红曲霉单菌落图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做出详细说明，应当了解，实施例只用于说明本发明，而不是用于对本发明进行限定，任何在本发明基础上所做的修改、等同替换等均在本发明的保护范围内。

实施例1

使用1ml不同浓度乳酸(100％、50％、25％、12.5％)溶液对清香型白酒酒曲样品进行培养分离红曲霉，结果如图1所示，滴加100％浓度的乳酸样品平板中，出现不同形态、颜色的菌落数量、种类较少，无杂菌长出。滴加50％浓度的乳酸样品平板中，出现不同形态、颜色的菌落数量、种类较多，无杂菌长出。滴加25％浓度的乳酸样品的平板中，有其他霉菌长出，覆盖平板，无法进行快速有效分离。滴加12.5％浓度的乳酸样品的平板中有其他霉菌、酵母、细菌长出，无法进行快速有效分离。

其中，100％乳酸溶液的具体配置方法为：量取100ml的纯乳酸于锥形瓶中，于121℃灭菌20min。

50％乳酸溶液的具体配置方法为：量取50ml的纯乳酸、50ml的蒸馏水，于锥形瓶中混合均匀，于121℃灭菌20min。

25％乳酸溶液的具体配置方法为：量取25ml的纯乳酸、75ml的蒸馏水，于锥形瓶中混合均匀，于121℃灭菌20min。

12.5％乳酸溶液的具体配置方法为：量取12.5ml的纯乳酸、87.5ml的蒸馏水，于锥形瓶中混合均匀，于121℃灭菌20min。

通过对50％浓度的乳酸样品平板中不同形态、颜色的菌落进行划线分离，结果发现灰白色至橙红色菌落均为不同种类的红曲霉，无其他杂菌分出。故可选择50％的乳酸溶液来分离培养样品中的红曲霉，达到分离红曲霉种类、数量多，无杂菌干扰分离效果，提高分离效率。

实施例2

使用本发明方法，将0.1g酱香型白酒酒曲样品均匀的平铺于已凝固的土豆汁琼脂培养基上，取1ml已灭菌的50％乳酸溶液直接滴加，湿润覆盖平板中的酒曲样品。30℃进行培养，不断观察及时挑选培养基上的灰白色至橙红色菌落，于新的pda培养基上进行划线分离纯化，共计分离出8株菌落形态各异的红曲霉，编号红曲霉j1-j8，其中包含传统方法分离到的4株红曲霉，即编号为红曲霉j1-j4，具体结果见图2。该分离方法得到的红曲霉种类多，覆盖传统分离方法得到的红曲霉种类。实验操作简单，分离平板中红曲霉以独立菌落形式存在，无杂菌干扰，进行简单的划线分离，即可得到红曲霉单菌落，周期短，具有较明显优势。

对比例1

传统的分离纯化方法为：1.0g酱香型白酒酒曲样品溶于100ml无菌水中制成菌悬液，震荡30min后，进行10倍递增稀释，再分别取不同稀释度的菌液100ul于pda培养基中进行涂布，选取平板中的红色菌落进行分离划线纯化，共计分离4株菌落形态各异的红曲霉，为红曲霉m116、m125、m127、m155(见图2)。实验过程中，杂菌较多，易覆盖平板，不利于红曲霉的分离，需进行多轮次的划线纯化，得到红曲霉的单菌落。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。