本发明属于食品工业技术领域，具体地说，涉及一种乳酸菌菌种微生物发酵工艺。
背景技术：
苹果醋是苹果(汁)为发酵原料，经过酒精发酵、醋酸发酵酿造而成的一种营养丰富、风味独特的食品，不仅富含人体所需要的氨基酸和微量元素，而且含有低分子多糖及多种有机酸等成分，提高了营养价值及保健功能，具有改善消化系统、调节内分泌，提高身体免疫力，降低血脂，排毒保健的效果。
果醋在我国具有悠久的历史，又是近几年发展起来的兼具调味品和饮料功能的新型健康食品，发展果醋具有广阔的前景，随着人们对果醋产品的需求在不断增加，对果醋产品的质量也越来越高。优良的菌种和工艺是影响苹果醋品质的关键因素，其中酒精发酵对苹果醋的品质及原料转化有着重要意义。发酵后产生的乳酸，具有促进了苹果醋口感的柔和性，而还会产生乙酸乙酯和辛酸乙酯，其具有明显水果香气和甜味，三者相结合，丰富了苹果醋的嗅觉和味觉，对苹果醋的口感风味产生积极影响。然而，传统的苹果醋发酵工艺具有微生物种类少、酶系不丰富；产品的色泽、风味都较差、质量不稳定的缺陷。同时传统的苹果醋发酵工艺得到的产品，降血压功能或抗氧化活性低。
技术实现要素：
1、要解决的问题
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种乳酸菌菌种微生物发酵工艺，本发明制备的产品，工艺简单、易于制作，具体来说，获取的苹果醋具有较好的降血压作用，其ic50值可低至0.015mg/ml，说明其ace抑制活性高，同时，其具有较好的抗氧化活性，其对dpph自由基的清除率可高达96.2％。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种乳酸菌菌种微生物发酵工艺，包括以下步骤：
(1)菌种准备：准备乳酸菌菌种，冷冻贮藏，待用；
(2)发酵基质准备：准备苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜及水，阴凉处无菌贮藏，待用；
(3)发酵处理：将步骤(1)中乳酸菌菌种加入到步骤(2)中发酵基质中，并转移到发酵罐中进行发酵；
(4)纯化处理：将步骤(3)发酵处理后发酵液进行离心处理，接着进行过滤处理，得到澄清液；
(5)成品处理：将步骤(4)纯化处理后澄清液，无菌罐装，储藏即可。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的乳酸菌菌种为保加利亚乳酸杆菌、红曲霉及醋酸杆菌的混合物；
其中所述的保加利亚乳酸杆菌、所述的红曲霉、所述的醋酸杆菌三者之间的质量比5：2：1。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的保加利亚乳酸杆菌、所述的红曲霉、所述的醋酸杆菌均采购自微康益生菌(苏州)股份有限公司。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(2)中苹果块的平均直径为2mm；
步骤(2)中苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜、水五者之间的质量比为110：15：2：8：150。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的温度为45℃。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的时间为3d。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(4)中离心处理的转速为8000rpm；
步骤(4)中过滤处理的孔径为200μm。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(5)中储藏的环境参数为阴凉干燥处。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明制备的产品，工艺简单、易于制作，具体来说，获取的苹果醋具有较好的降血压作用，其ic50值可低至0.015mg/ml，说明其ace抑制活性高，同时，其具有较好的抗氧化活性，其对dpph自由基的清除率可高达96.2％。本发明在现有技术的基础上，设置合适的原料及其比例关系，并创新设计多菌种混合形式。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
需要提醒的是，本申请的乳酸菌菌种是以保加利亚乳酸杆菌为主体，红曲霉和醋酸杆菌为辅菌。
其中保加利亚乳酸杆菌的货号为bk0566；
其中红曲霉的货号为nc0391；
其中醋酸杆菌的货号为fd0160。
需要提醒的是，常规的保加利亚乳酸杆菌、红曲霉及醋酸杆菌都可以实现；
需要提醒的是，经过本发明的发酵工艺可得到苹果醋。
实施例1
本实施例的乳酸菌菌种微生物发酵工艺，包括以下步骤：
(1)菌种准备：准备乳酸菌菌种，冷冻贮藏，待用；
(2)发酵基质准备：准备苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜及水，阴凉处无菌贮藏，待用；
(3)发酵处理：将步骤(1)中乳酸菌菌种加入到步骤(2)中发酵基质中，并转移到发酵罐中进行发酵；
(4)纯化处理：将步骤(3)发酵处理后发酵液进行离心处理，接着进行过滤处理，得到澄清液；
(5)成品处理：将步骤(4)纯化处理后澄清液，无菌罐装，储藏即可。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的乳酸菌菌种为保加利亚乳酸杆菌、红曲霉及醋酸杆菌的混合物；
其中所述的保加利亚乳酸杆菌、所述的红曲霉、所述的醋酸杆菌三者之间的质量比5：2：1。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的保加利亚乳酸杆菌、所述的红曲霉、所述的醋酸杆菌均采购自微康益生菌(苏州)股份有限公司。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(2)中苹果块的平均直径为2mm；
步骤(2)中苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜、水五者之间的质量比为110：15：2：8：150。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的温度为45℃。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的时间为3d。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(4)中离心处理的转速为8000rpm；
步骤(4)中过滤处理的孔径为200μm。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(5)中储藏的环境参数为阴凉干燥处。
对比例1
本实施例的乳酸菌菌种微生物发酵工艺，包括以下步骤：
(1)菌种准备：准备乳酸菌菌种，冷冻贮藏，待用；
(2)发酵基质准备：准备苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜及水，阴凉处无菌贮藏，待用；
(3)发酵处理：将步骤(1)中乳酸菌菌种加入到步骤(2)中发酵基质中，并转移到发酵罐中进行发酵；
(4)纯化处理：将步骤(3)发酵处理后发酵液进行离心处理，接着进行过滤处理，得到澄清液；
(5)成品处理：将步骤(4)纯化处理后澄清液，无菌罐装，储藏即可。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的乳酸菌菌种为保加利亚乳酸杆菌、红曲霉及醋酸杆菌的混合物；
其中所述的保加利亚乳酸杆菌、所述的红曲霉、所述的醋酸杆菌三者之间的质量比5：2：1。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的保加利亚乳酸杆菌、所述的红曲霉、所述的醋酸杆菌均采购自微康益生菌(苏州)股份有限公司。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(2)中苹果块的平均直径为2mm；
步骤(2)中苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜、水五者之间的质量比为110：15：2：8：150。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的温度为45℃。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的时间为3d。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(4)中离心处理的转速为8000rpm；
步骤(4)中过滤处理的孔径为200μm。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(5)中储藏的环境参数为阴凉干燥处。
对比例2
本实施例的乳酸菌菌种微生物发酵工艺，包括以下步骤：
(1)菌种准备：准备乳酸菌菌种，冷冻贮藏，待用；
(2)发酵基质准备：准备苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜及水，阴凉处无菌贮藏，待用；
(3)发酵处理：将步骤(1)中乳酸菌菌种加入到步骤(2)中发酵基质中，并转移到发酵罐中进行发酵；
(4)纯化处理：将步骤(3)发酵处理后发酵液进行离心处理，接着进行过滤处理，得到澄清液；
(5)成品处理：将步骤(4)纯化处理后澄清液，无菌罐装，储藏即可。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的乳酸菌菌种为保加利亚乳酸杆菌、红曲霉及醋酸杆菌的混合物；
其中所述的保加利亚乳酸杆菌、所述的红曲霉、所述的醋酸杆菌三者之间的质量比5：2：1。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的保加利亚乳酸杆菌、所述的红曲霉、所述的醋酸杆菌均采购自微康益生菌(苏州)股份有限公司。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(2)中苹果块的平均直径为2mm；
步骤(2)中苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜、水五者之间的质量比为110：10：2：15：120。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的温度为45℃。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的时间为3d。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(4)中离心处理的转速为8000rpm；
步骤(4)中过滤处理的孔径为200μm。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(5)中储藏的环境参数为阴凉干燥处。
对比例3
本实施例的乳酸菌菌种微生物发酵工艺，包括以下步骤：
(1)菌种准备：准备乳酸菌菌种，冷冻贮藏，待用；
(2)发酵基质准备：准备苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜及水，阴凉处无菌贮藏，待用；
(3)发酵处理：将步骤(1)中乳酸菌菌种加入到步骤(2)中发酵基质中，并转移到发酵罐中进行发酵；
(4)纯化处理：将步骤(3)发酵处理后发酵液进行离心处理，接着进行过滤处理，得到澄清液；
(5)成品处理：将步骤(4)纯化处理后澄清液，无菌罐装，储藏即可。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的乳酸菌菌种为醋酸杆菌的混合物。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的醋酸杆菌采购自微康益生菌(苏州)股份有限公司。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(2)中苹果块的平均直径为2mm；
步骤(2)中苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜、水五者之间的质量比为110：15：2：8：150。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的温度为45℃。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的时间为3d。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(4)中离心处理的转速为8000rpm；
步骤(4)中过滤处理的孔径为200μm。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(5)中储藏的环境参数为阴凉干燥处。
对比例4
本实施例的乳酸菌菌种微生物发酵工艺，包括以下步骤：
(1)菌种准备：准备乳酸菌菌种，冷冻贮藏，待用；
(2)发酵基质准备：准备苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜及水，阴凉处无菌贮藏，待用；
(3)发酵处理：将步骤(1)中乳酸菌菌种加入到步骤(2)中发酵基质中，并转移到发酵罐中进行发酵；
(4)纯化处理：将步骤(3)发酵处理后发酵液进行离心处理，接着进行过滤处理，得到澄清液；
(5)成品处理：将步骤(4)纯化处理后澄清液，无菌罐装，储藏即可。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的乳酸菌菌种为红曲霉。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的红曲霉采购自微康益生菌(苏州)股份有限公司。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(2)中苹果块的平均直径为2mm；
步骤(2)中苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜、水五者之间的质量比为110：15：2：8：150。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的温度为45℃。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的时间为3d。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(4)中离心处理的转速为8000rpm；
步骤(4)中过滤处理的孔径为200μm。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(5)中储藏的环境参数为阴凉干燥处。
对比例5
本实施例的乳酸菌菌种微生物发酵工艺，包括以下步骤：
(1)菌种准备：准备乳酸菌菌种，冷冻贮藏，待用；
(2)发酵基质准备：准备苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜及水，阴凉处无菌贮藏，待用；
(3)发酵处理：将步骤(1)中乳酸菌菌种加入到步骤(2)中发酵基质中，并转移到发酵罐中进行发酵；
(4)纯化处理：将步骤(3)发酵处理后发酵液进行离心处理，接着进行过滤处理，得到澄清液；
(5)成品处理：将步骤(4)纯化处理后澄清液，无菌罐装，储藏即可。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的乳酸菌菌种为保加利亚乳酸杆菌。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(1)中所述的保加利亚乳酸杆菌采购自微康益生菌(苏州)股份有限公司。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(2)中苹果块的平均直径为2mm；
步骤(2)中苹果块、黄原胶、硫酸镁、蜂蜜、水五者之间的质量比为110：15：2：8：150。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的温度为45℃。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(3)中发酵的时间为3d。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(4)中离心处理的转速为8000rpm；
步骤(4)中过滤处理的孔径为200μm。
上述所述的乳酸菌菌种微生物发酵工艺中，步骤(5)中储藏的环境参数为阴凉干燥处。
对比例6
中国发明，申请号：cn202011318551.4，公开号：cn112226331a，公开了一种用苹果酸-乳酸发酵法酿造苹果醋的方法，其具体技术方案如下：
“一种用苹果酸-乳酸发酵法酿造苹果醋的方法，所述用苹果酸-乳酸发酵法酿造苹果醋的方法包括如下步骤：
s1.以红富士苹果为发酵原料，经过洗净、切碎后榨汁，在榨汁过程中加入100mg/l的so2，得到澄清的榨汁液体，加入白砂糖调配糖度为18％，调节酸度为5g/l，在80℃灭菌20min，冷却至20℃备用；将干酵母添加量按质量比0.03％添加到40℃无菌纯水(50ml)进行活化20min；将活化好的酵母菌液，接种至发酵液中，摇匀，20℃下进行酒精发酵，同时监测发酵糖度和酒精度。
s2.分别取酒酒球菌和植物乳杆菌1ml甘油保存菌种，加入25ml的mrs培养基中，在30℃培养24h，得到一级种子菌液，再按照4％的添加量加入到mrs培养基中，30℃发酵24h，测定菌种密度为od600为2.0，得到二级种子菌液，将两种菌液按质量比1:4的添加量混合，得到乳酸发酵菌液；
在澄清的榨汁液体的酒精发酵的过程中，当所述澄清的榨汁液体中所测得的酒精度为5.0％(v/v)时，调整其ph为3.0，然后加入乳酸发酵菌液，触发苹果酸-乳酸发酵，乳酸发酵菌液按照澄清的榨汁液体的4％的量加入，在25℃下发酵5天，得到中间产物；
将中间产物加入0.08g/100g的硅藻土进行过滤，过滤澄清后，在75℃灭菌20min，冷却备用。
s3.取1ml醋酸菌甘油保存菌种，加入500ml三角瓶中(分装100ml)，8层纱布封口，在30℃、150r/min摇床培养48h，得到一级种子液，二次培养的醋酸菌按中间产物的10vt％的量加入，在30℃、150r/min摇床培养48h进行扩大培养；
调配酒精度为5.0％(v/v)，在75℃灭菌20min，将扩培好的醋酸菌按照10wt％的添加量加入到中间产物中，在醋酸发酵罐中33℃下，发酵24h，得到粗产物；
s4.将粗产物加入1.0g/100g的硅藻土进行过滤，过滤澄清后，在75℃灭菌20min，得到最终产物”。
对比例7
中国发明，申请号：cn201911367657.0，公开号：cn111057637a，公开了一种富含游离氨基酸的多菌种发酵苹果醋及其生产工艺，其具体技术方案如下：
“(1)苹果汁制备：挑选完整，新鲜的苹果110kg，清洗，去皮及去核，破碎，榨汁，向汁液中加入水50kg和蔗糖8kg，混合后按重量比(g/kg)加入酶活20万u/g的果胶酶0.50g/kg，酶活4万u/g的β-葡萄糖苷酶0.20g/kg，在55℃条件下酶解5h，得到苹果汁；
(2)酒精发酵：在步骤(1)得到的苹果汁中按重量比(g/kg)加入酵母菌cicc10451×109个/kg和植物乳杆菌cgmccno.183902×1010个/kg，置于37℃条件下发酵6天获得苹果酒；
(3)醋酸发酵：在步骤(2)得到的苹果酒中按质量比(g/kg)加入醋酸菌cicc20441109个/kg，30℃条件下发酵5天，得到苹果醋发酵液；
(4)苹果醋制备：发酵液离心，过滤，灭菌，包装，即可得到富含游离氨基酸的多菌种发酵苹果醋”。
对比例8
中国发明，申请号：cn201910366976.3，公开号：cn109943461a，公开了一种高酸度苹果醋的发酵方法，其具体技术方案如下：
“把苹果浓缩汁糖度调整至18-25％，加入适量的活性干酵母菌，在20℃-25℃进行酒精发酵，酒精含量为9％-13％时停止发酵。把苹果酒经过过滤和巴氏杀菌后放入发酵罐中，接种扩培的醋酸菌液，在32℃-35℃下进行第一轮发酵，发酵45小时，检测总酸含量为5.3g/100ml，酒度为0.2％，得到成品醋。
在下一轮醋酸发酵进行发酵罐配料时，加入10％的已制成的成品醋，接种扩培的醋酸菌液，在32℃-35℃下进行发酵，发酵34小时，检测总酸含量为7.8g/100ml,酒度为0.3％时发酵结束。将发酵结束的苹果醋进行高温瞬时灭菌，再用过滤机进行过滤，得到清澈透明的苹果醋”。
实施例2
选择实施例1制备的产品以及对比例1-8制备的产品，进行如下实验：
借鉴下述实验方法并依托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测试。
ace抑制能力按照如下方法进行测定：
ace抑制率的方法。用高效液相色谱在228nm下定量检测释放出的hip量，从而计算出其ace抑制率。
(1)试剂的配置
ph8.3的磷酸盐缓冲溶液：用超纯水配制，其中含磷酸盐50mmol/l，nacl300mmol/l，调整ph到8.3；
ace酶液：将2ml的磷酸盐缓冲液加入1u的ace中，使其浓度变为0.5u/ml。
hhl溶液：使用磷酸缓冲液溶解hhl，使其终浓度为5mmol/l。
样品溶液：称取适量样品，用磷酸盐缓冲液所需浓度的溶液。
(2)ace抑制率测定的色谱条件
检测波长：228nm；流速：1ml/min；流动相a：超纯水(含0.1％三氟乙酸)，流动相b：甲醇(含0.1％三氟乙酸)；进样量：10μl，手动进样。
(3)测定ace抑制活性的方法
取120μlhhl底物溶液，加入20μl的样品混合均匀，在37℃恒温水浴中保温10min。然后加入10μlace酶液在37℃恒温水浴中反应30min，再加入150μl1mol/l的hcl终止反应，得到反应液。该反应液利用hplc进行分析，同时设置空白对照组。ace抑制活性计算公式如下：
ace抑制活性％＝(m-n)/m×100％
式中，m为对照组中马尿酸的峰面积，n为添加的样品组中马尿酸的峰面积。
(4)半抑制浓度的测定
按照ace抑制肽体外检测方法测定其抑制活性，以浓度为横坐标，ace抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算出ic50值
上述相关测试如表1所示，
表1
由表1可知，本发明中实施例1-5制备的产品具有很好的ace(血管紧张素转化酶)抑制活性，其ic50值仅为0.015mg/ml。需要注意的是，ace浓度越高，导致血管收缩占优势，血压升高。抑制ace的活性是治疗高血压的重要途径之一。
抗氧化能力按照如下方法进行测定：
对dpph自由基的清除作用
样品溶于双蒸水配制成一系列质量浓度梯度的样品溶液，取2ml各质量浓度的样品，加入到2ml0.1mmol/ldpph溶液(溶于无水乙醇)中。混合均匀后，室温下放置30min后在517nm测得各个质量浓度样品吸光度(ai)。平行测定3次，取平均值。同时以2ml样品溶液加入2ml无水乙醇测得吸光度(aj)。除此之外，在取2ml无水乙醇代替样品加入2mldpph自由基溶液测得空白吸光度(ao)。按照式(i)计算dpph自由基清除率。
上述相关测试如表2所示，
表2
由表2可知，本发明制备的产品具有很好的抗氧化活性，其对dpph自由基的清除率高达92.8％。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。