一种检测牛结节性皮肤病的Cycleave荧光PCR方法与流程

本发明属牛病病原微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测牛结节性皮肤病的cycleave荧光pcr引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法。

背景技术：

牛结节性皮肤病(lumpyskindisease，lsd)是一种由痘病毒科(poxviridae)、羊痘病毒属(capripoxvirus，capv)的牛结节性皮肤病病毒(lumpyskindiseasevirus，lsdv)引起的急性、亚急性传染病，主要特征是发热，皮肤、粘膜上结节样病变和淋巴结肿大等。

牛是该病毒的特异性宿主，发病可导致奶牛产奶量下降、公牛短暂或永久不育、怀孕牛流产、皮革损坏以及继发细菌感染导致死亡。该病曾于非洲、中东、东欧等地区多个国家流行并造成巨大经济损失。

检测时，通过发热、皮肤结节样变化、淋巴结肿大等临床症状可初步诊断该病，但其确诊需依赖实验室检测，特别是疾病处于潜伏期或前驱期时。而且患病牛产生皮肤损伤的症状易与皮肤癣病、昆虫叮咬等易混淆；发病期，患病牛结节处可呈现黏膜坏死、破溃等症状，需与口蹄疫、蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎等进行鉴别。此外，还存在无临床症状的隐性感染的情况，均需进行实验室检测确诊。因此，开发快速、准确、简便的lsd特异性检测方法是防控该病的关键。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种cycleave荧光pcr引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法，从而实现对牛结节性皮肤病病毒特异、敏感、快速的检测。

本发明首先提供一种检测牛结节性皮肤病病毒的引物对和探针，引物对和探针序列信息如下：

牛结节性皮肤病病毒检测正向引物lsdforward：

5′-cgatacactctccratatc-3′(seqidno:1)

牛结节性皮肤病病毒检测反向引物lsdreverse：

5′-aacgagaagtatgaattagc-3′(seqidno:2)

牛结节性皮肤病病毒检测探针lsdprobe：

5′-ggccgcc-3′(seqidno:3)

其中，检测探针lsdprobe的5′端进行羧基荧光素fam标记，3′端进行淬灭基团eclipse标记，下划线位置为标记的rna位点。

上述引物和探针用于制备检测牛结节性皮肤病病毒的cycleave荧光pcr检测体系。

进一步，本发明还提供检测牛结节性皮肤病病毒核酸的cycleave荧光pcr方法，包括如下的步骤：

1)cycleave荧光pcr反应体系配制

反应液每管25μl，含有2×cycleavepcr反应液12.5μl，5pmol/μl的lsdforward和lsdreverse各0.6μl，5pmol/μl的lsdprobe0.8μl，双蒸水8.5μl，待检测样品dna模板2μl。其中，cycleavepcr检测试剂盒(目录号：cy505a)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。

2)cycleave荧光pcr反应体系扩增

检测反应条件设置为：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s(收集fam信号)，共40个循环。

3)结果判定

阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品无ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。

本发明所提供的cycleave荧光pcr检测牛结节性皮肤病病毒的引物、探针及方法，具有如下的技术优点：

1)灵敏度高：扩增模板的最低检出限可达1.13×10⁰copies/μl，约合2copies/反应；2)特异性好：采用cycling标记的荧光探针，特异性针对lsdv基因组产生荧光扩增信号，经验证对同属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒，及常见的口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、蓝舌病病毒等相关牛病病毒，均无交叉反应；3)快速高通量：检测速度快，加入样品后40分钟内即可完成整个扩增检测过程，且根据荧光定量pcr仪的检测孔数量，可以一次性实现96～384个样品的同步检测；4)操作简便：配置好的cycleavepcr反应体系，置于荧光定量pcr仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。

附图说明

图1：本发明扩增lsdvorf024基因部分序列的引物和探针设计示意图，其中引物探针设计区域由方框圈出。

图2：阳性质粒制备电泳结果图，其中泳道1：2000bpmarker；泳道2：lsdv/china/xj/2019-1。

图3：cycleavepcr灵敏度试验结果图，其中1：工作标准品1；2：工作标准品2；3：工作标准品3；4：工作标准品4；5：工作标准品5；6：工作标准品6；7：工作标准品7；8：工作标准品8；9：工作标准品9；10：阴性对照。

图4：cycleavepcr标准曲线结果图，其中1：工作标准品1；2：工作标准品2；3：工作标准品3；4：工作标准品4；5：工作标准品5；6：工作标准品6；7：工作标准品7；8：工作标准品8。

图5：cycleavepcr特异性试验结果图，其中1：工作标准品4；2：绵羊痘病毒；3：山羊痘病毒；4：o型/a型口蹄疫病毒；5：牛病毒性腹泻-黏膜病病毒与传染性鼻气管炎病病毒；6：蓝舌病病毒；7：阴性对照。

具体实施方式

本发明采用的cycleave荧光pcr是采用一对引物和一个嵌合有rna位点的dna探针扩增模板，当探针与互补的目标dna杂交时，在rna位点连接处切割探针，产生标记荧光，通过实时监测荧光信号实现检测目的。

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。

实施例1：引物及探针的筛选与设计

牛结节性皮肤病病毒(lumpyskindiseasevirus,lsdv)属于羊痘病毒属，同属还有山羊痘病毒(goatpoxvirus,gtpv)和绵羊痘病毒(sheeppoxvirus,sppv)，已有研究显示三种病毒间具有较高基因组同源性。

为了避免检测lsdv时出现假阳性，首先，从ncbi数据库中查找并下载已有的全部27株lsdv基因组全序列(genbank登录号：mn636843.1、mn636842.1、mn636841.1、mn636840.1、mn636839.1、mn636838.1、mk4418381、mh646674.1、kx764645.1、kx764644.1、kx764643.1、mt992618.1、mt130502.1、af409137.1、mn995838.1、mn642592.1、mn072619.1、kx894508.1、mh893760.2、ky829023.3、ky829023.3、ky702007.1、kx683219.1、mt130502.2、mt643825.1、af325528.1、af409138.1)，已有全部12株gtpv基因组全序列(genbank登录号：kx576657.1、ay077836.1、ay077835.1、mn072621.1、mn072620.1、mh381810.1、kc951854.1、mw020570.1、mn072622.1、mn072625.1、mn072624.1、mn072623.1)和全部13株sppv基因组全序列(genbank登录号：mn072631.1、mn072630.1、mn072629.1、mn072628.1、mn072627.1、mn072626.1、mw020571.1、mg000156.1、ay077834.1、ay077833.1、ay077832.1、kt438551.1、kt438550.1)。

再利用生物信息学软件blast和lasergenemegalign，逐段将上述lsdv、gtpv、sppv基因组全序列进行比较，分析筛选了4个lsdv种特异性单核苷酸多态性位点(singlenucleotidepolymorphism,snp)，即orf024基因y51g与a287g，orf101基因a1671t与t1743c。针对上述的snp位点，综合考虑snp位点两翼序列的保守性、碱基组成、gc含量、二级结构的形成、tm值等因素，设计了4组检测lsdv的cycleave荧光pcr引物探针方案(表1)。

表1：lsdv种特异性snp位点及引物探针组设计表

简并碱基y＝t/c，r＝a/g；探针中加粗标记为lsdv特异性snp位点，下划线为rna碱基位点，u表示尿嘧啶。

经过灵敏性、特异性验证后，本发明最终采用方案2所示的引物探针组合。以lsdvni-2490株(genbank登录号：af325528.1)作为参考株，设计引物用于扩增lsdvorf024基因第238～388位序列，设计探针含lsdv特异性snp位点。引物和探针设计区域见图1。其具体序列信息如下：

牛结节性皮肤病病毒检测正向引物lsdforward：

5′-cgatacactctccratatc-3′(seqidno:1)

牛结节性皮肤病病毒检测反向引物lsdreverse：

5′-aacgagaagtatgaattagc-3′(seqidno:2)

牛结节性皮肤病病毒检测探针lsdprobe：

5′-ggccgcc-3′(seqidno:3)

其中，牛结节性皮肤病病毒检测探针lsdprobe针的5′端进行羧基荧光素fam标记，3′端进行淬灭基团eclipse标记，下划线位置为标记的rna位点。引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

实施例2：筛选的引物对、探针的灵敏度实验

1、阳性质粒标准品的制备

1)阳性质粒的制备

中国流行株lsdv/china/xj/2019-1病毒由中国动物卫生与流行病学中心分离、鉴定、保存及提供。采用商品化病毒基因组提取试剂盒按说明方法提取病毒dna模板，进行常规pcr扩增，具体步骤如下：

反应液每管25μl，含有2×platinumsupergreenpcrmix反应液12.5μl，10pmol/μl的lsdforward和lsdreverse各1μl，双蒸水8.5μl，提取的dna模板2μl。其中，platinumsupergreenpcrmix检测试剂盒(目录号：00766789)购自invitrogen公司。二是反应条件设置：95℃预变性5min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，72℃最后延伸5min；4℃保存。

pcr产物经3％琼脂糖凝胶电泳(见图2)，回收目的片段并连接pmd19-t载体，转化dh5α大肠杆菌，经pcr鉴定阳性菌株送青岛睿博兴科公司测序。测序结果符合预期作为阳性菌种，提取其质粒作为阳性质粒。阳性质粒含orf024基因第238～388位序列，及lsdv特异性snp位点a287g。序列如下：

5′-cgatacactctccgatatctaaagtttgaatatcaatcacattagttacggcggccgaagaagtacatttgcgtattatttcgggtatataatttttatcttgattatccaaatcaatcccgacttcgttcgctaattcatacttctcgtt-3′

(注：下划线区域表示引物匹配位置；下划线斜体区域为探针匹配位置；阴影为snp位点位置；加粗为rna碱基位置)

2)阳性质粒标准品的制备

采用超微量紫外分光光度计测定阳性质粒od260/od280比值及浓度(单位ng/μl)，根据公式：质粒拷贝数(copies/μl)＝(质粒浓度×10^-9×稀释倍数×6.02×10²³)/(660道尔顿/碱基×碱基数)，计算其拷贝数。

经测定阳性质粒od260/od280比值为1.98，初始浓度为250.9ng/μl，拷贝数为1.13×10¹¹copies/μl，进行10倍梯度稀释，制备标准品分别为：工作标准品1，含有1.13×10⁷copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品2，含有1.13×10⁶copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品3，含有1.13×10⁵copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品4，含有1.13×10⁴copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品5，含有1.13×10³copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品6，含有1.13×10²copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品7，含有1.13×10¹copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品8，含有1.13×10⁰copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品9，含有1.13×10^-1copies/μl阳性质粒非传染性dna片段。

2、灵敏度检测的实施

采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对系列工作标准品和阴性对照(成分为无核酸酶水)进行检测并绘制标准曲线，具体步骤如下：

(1)反应体系配制：反应液每管25μl，含有2×cycleavepcr反应液12.5μl，5pmol/μl的lsdforward和lsdreverse各0.6μl，5pmol/μl的lsdprobe0.8μl，双蒸水8.5μl，待检测样品dna模板2μl。其中，cycleavepcr检测试剂盒(目录号：cy505a)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(2)反应条件设置：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s(收集fam信号)，共40个循环。(3)结果的判定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品无ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。

结果如图3所示，工作标准品1～8均出现典型扩增曲线，检测结果为阳性；工作标准品9和阴性对照无扩增曲线，检测结果为阴性。结果显示，本方法最低检出限为工作标准品8，灵敏度为2.26copies/反应。选取梯度稀释的工作标准品1～8绘制标准曲线，如图4所示，标准曲线的线性方程为：y＝-2.723x+38.388，r2＝0.999，扩增效率e＝132.9％。结果说明本发明所使用的引物对和探针具有极高的扩增效率，且在检测范围内模板浓度与检测ct值间具有良好线性关系。

实施例3重复性实验

采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对实施例2中制备的工作标准品2～6进行三次cycleave荧光pcr重复检测，计算批间变异系数；在同次cycleave荧光pcr中重复检测三次，计算批内变异系数，具体步骤如下：

(1)反应体系配制：反应液每管25μl，含有2×cycleavepcr反应液12.5μl，5pmol/μl的lsdforward和lsdreverse各0.6μl，5pmol/μl的lsdprobe0.8μl，双蒸水8.5μl，待检测样品dna模板2μl。其中，cycleavepcr检测试剂盒(目录号：cy505a)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(2)反应条件设置：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s(收集fam信号)，共40个循环。(3)结果判定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。重复检测工作标准品2～6，分别统计3次批间和3次批内重复检测的ct值，按变异系数cv％＝(标准偏差sd/平均值mean)×100％，计算批间和批内重复ct值变异系数。

结果如表2所示，工作标准品2～6批内重复性检测和批间重复性检测ct值变异系数均小于2％，表明本方法具有良好的可重复性。

表2：批内和批间重复性检测结果表

实施例4特异性实验

采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对牛病毒性腹泻/黏膜病病毒等相关病毒样品，健康牛来源全血、唾液、皮肤样品，以及阳性对照(成分为实施例2中制备的工作标准品4)和阴性对照(成分为无核酸酶水)进行检测，具体步骤如下：

(1)特异性样品制备：健康牛来源全血、唾液、皮肤样品，由国家外来动物疫病研究中心采集与提供；山羊痘病毒av41株、口蹄疫病毒o型和a型(fmdv/re-o/mya98/jscz2013+fmdv/re-a/wh/09株)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒和牛传染性鼻气管炎病毒(nmg株+ly株)来源市售商品化疫苗；绵羊痘病毒gl株dna模板由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠；蓝舌病病毒dna模板由军事医学科学院军事兽医研究所惠赠。全血、唾液、病毒样品直接采用商品化dna提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取核酸；皮肤样品先进行匀浆，再采用商品化dna提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取核酸，获得的核酸样本于-20℃保存备用。(2)反应体系配制：反应液每管25μl，含有2×cycleavepcr反应液12.5μl，5pmol/μl的lsdforward和lsdreverse各0.6μl，5pmol/μl的lsdprobe0.8μl，双蒸水8.5μl，待检测样品dna模板2μl。其中，cycleavepcr检测试剂盒(目录号：cy505a)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(3)反应条件设置：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s(收集fam信号)，共40个循环。(4)结果的判定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品无ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。

结果如图5，阳性对照出现典型扩增曲线，阴性对照未出现扩增信号，实验成立。本实验中检测的相关山羊痘病毒、绵羊痘病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒样本核酸均未出现扩增信号，表明本方法检测上述病毒均无交叉反应，具有良好的特异性。

实施例5实际临床样本的检测

采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对采集自临床疑似感染动物的血液等类型临床样品，以及阳性对照(成分为实施例2中制备的工作标准品4)和阴性对照(成分为无核酸酶水)进行检测；同时参照国家标准《牛结节性皮肤病诊断技术》(gb/t39602-2020)方法对临床样品进行平行检测。具体步骤如下：

(1)临床样品的制备：临床疑似感染牛结节性皮肤病牛的全血、唾液、皮肤结节样品共计89份，由内蒙古自治区动物疫病预防与控制中心采集与提供。全血、唾液样品直接采用商品化dna提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取核酸；结节样品先进行匀浆，再采用商品化dna提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取核酸，获得的核酸样本于-20℃保存备用。

(2)cycleave荧光pcr方法：一是反应体系配制：反应液每管25μl，含有2×cycleavepcr反应液12.5μl，5pmol/μl的lsdforward和lsdreverse各0.6μl，5pmol/μl的lsdprobe0.8μl，双蒸水8.5μl，待检测样品dna模板2μl。其中，cycleavepcr检测试剂盒(目录号：cy505a)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。二是反应条件设置为：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s(收集fam信号)，共40个循环。三是结果的判定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品无ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。

(3)国标方法：参照国家标准《牛结节性皮肤病诊断技术》(gb/t39602-2020)中通用牛结节性皮肤病病毒核酸检测方法进行。

检测结果见表3，cycleave荧光pcr方法检出牛结节性皮肤病病毒核酸阳性53份、阴性36份；国标方法检出牛结节性皮肤病病毒核酸阳性49份、阴性40份。与国标方法相比，cycleave荧光pcr方法敏感性为100％，特异性为90％，总符合率为95.5％。将与国际方法检测结果不一致的4份样品，回收扩增片段并测序鉴定，证实均为牛结节性皮肤病病毒核酸阳性。结果显示，cycleave荧光pcr方法与国标荧光定量pcr方法检测结果间符合率良好，同时具有更高的阳性检出率。

表3：cycleave荧光pcr与国标方法平行检测临床样品结果表

综上，本发明的引物对、探针及使用该引物对、探针的cycleave荧光pcr方法特异敏感且简便快速，适用于我国牛结节性皮肤病的检测。

序列表

<110>中国动物卫生与流行病学中心

<120>一种检测牛结节性皮肤病的cycleave荧光pcr方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgatacactctccratatc19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aacgagaagtatgaattagc20

<210>3

<211>7

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggccgcc7