阻碍GlobinmRNA逆转录的探针组合物及其应用的制作方法

阻碍globin mrna逆转录的探针组合物及其应用
技术领域
1.本发明专利涉及阻碍globin mrna逆转录的探针组合物及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.随着高通量测序技术的发展和普及，rna测序已成为疾病诊断和科学研究的有效手段。
3.但是rna样本中包含大量的核糖体rna（rrna约占总rna的90%
‑
95%），占据了大量的rna测序数据，造成了测序数据的浪费和成本的上升。
4.市面上存在许多去除rrna的方法来提高rna测序有效数据的占比，如polya富集法、rnaseh探针消解去除法和生物素探针捕获去除法。
5.这些方法具有rna损耗严重、操作复杂、对低浓度低质量样本的去除效果差等缺陷，在低目标rna含量的rna测序上具有很大的应用局限性。
6.血液转录组测序是血液检测的常用手段之一。
7.血液样本来源的rna中globin mrna占据了mrna的75%以上。
8.因此相对于其他rna，血液转录组测序面临着目标rna占比更少、检测成本更高和检测难度更大等问题。
9.血液来源rna不仅要去除rrna，也要去除globin mrna，以保证测序数据中有效数据的占比。
10.传统的olya富集法、rnaseh探针消解去除法和生物素探针捕获去除法对于低目标rna含量的血液rna样本难以达到高效的去除效果，极大地降低的血液来源rna的检测效率和成功率，并提高了检测的成本。
11.最近，我们发明了一种利用逆转录阻碍探针组合物在rna建库过程中快速去除靶rna的方法，称为逆转录阻碍探针法，并申请了专利，申请号为cn202110257924 .x。
12.相较于传统的rna去除方法，逆转录阻碍探针法具有操作简单（一步）、耗时短（2分钟）、去除效率高、损失小、对非靶rna保留完整、基因检出率高和成本低等优点，是一种高效实用的靶rna去除技术。


技术实现要素：

13.本发明的目的是提供一种用于rna建库中快速去除靶rna的逆转录阻碍探针，可以快速去除rna建库中的rrna。
14.本发明采用的技术方案为：一种阻碍globin mrna逆转录的探针组合物，包括下表所示的20条探针ꢀ序号序列名称5
’‑3’
1globinprobe
‑
1gtttgaggttgctagtgaacaca2globinprobe
‑
2catccacgttcaccttgccccac
3globinprobe
‑
3atccccaaaggactcaaagaacc4globinprobe
‑
4ctaaaggcaccgagcactttct5globinprobe
‑
5acgtgcagcttgtcacagtgcag6globinprobe
‑
6ctttgccaaagtgatgggccagc7globinprobe
‑
7ggcattagccacaccagccacca8globinprobe
‑
8gggaacaaaggaacctttaatag9globinprobe
‑
9ggcagaatccagatgctcaaggc10globinprobe
‑
10accatggtgggttctctctgagt11globinprobe
‑
11actcgccagcgtgcgcgccgacc12globinprobe
‑
12tgcgggaagtaggtcttggtggt13globinprobe
‑
13gtcagcgcgtcggccaccttctt14globinprobe
‑
14gtcgctcagggcggacagcgcgt15globinprobe
‑
15ggcttaggagcttgaagttgacc16globinprobe
‑
16accgcaggggtgaactcggc17globinprobe
‑
17gcttaacggtatttggaggtcag18globinprobe
‑
18ggcccgttgggaggcccagc19globinprobe
‑
19tggggggaggcccaaggggcaa20globinprobe
‑
20ccactcagactttattcaaagac
15.优选的，所述探针的3’端被nh2c6修饰封闭。
16.优选的，所述探针中多个序列进行锁核酸修饰，使得探针的tm值高于80℃。
17.优选的，至少50%锁核酸修饰的位置处在探针5’端的前三分之一区域。
18.优选的，探针序列中斜体加粗碱基为lna修饰碱基。
19.优选的，所述探针组合物中任意两条探针的混合比例在1:1
‑
1:10之间。
20.本发明还公共了上述的探针组合物在rna建库中快速去除globin mrna的应用。
21.上述的应用，其步骤包括：（1）提取样本中的总rna，在总rna中加入探针组合物、随机引物和buffer，提高反应体系温度，使探针与globin mrna分子形成rna:dna的杂交双链，获得杂交混合物；（2）降低杂交混合物温度，使随机引物与其它rna分子形成rna:dna的杂交双链；（3）加入逆转录酶，生成一链cdna；（4）完成下游rna ngs文库的构建。
22.优选的，所述步骤（1）中反应温度在55℃以上。
23.优选的，所述步骤（2）中反应温度在25℃以下。
24.本发明的探针能够特异性地识别并结合人的球蛋白 rna，并阻碍球蛋白 rna的逆转录，进而在rna建库过程中去除球蛋白 rna的目的，能够在逆转录过程中有效去除血液样本rna中99.5％以上的globin mrna序列，且具有操作简单（一步）、耗时短（2 min）的优点，非常适用于大规模工业自动化。
25.这组探针用于血液样本rna建库中具有高效快速、操作简单、损失小、对低浓度低质量rna样本检出基因数高和成本低等优点，适用于血液来源rna样本的ngs检测，尤其是对于低质量血液rna样本的检测具有重要的应用价值。
26.将本专利中公布的球蛋白 rna探针和cn202110257924 .x中公布的核糖体rna逆转录阻碍探针组结合起来，能够在2分钟内快速高效地去除血液样本rna中rrna和globin mrna。
附图说明
27.图1 三种去除血液rna中globin mrna和rrna的建库方法流程示意图。
28.图2 globin mrna阻碍探针组合物在mrna
‑
seq中应用示意图。
29.图3 qsep检测globin mrna阻碍探针组合物投入量在mrna
‑
seq中对文库大小的影响。
30.图4 globin mrna阻碍探针组合物投入量在mrna
‑
seq中对文库产量的影响。
31.图5 globin mrna阻碍探针组合物投入量在mrna
‑
seq中的去除效率检测。
32.图6 globin mrna阻碍探针组合物投入量在mrna
‑
seq中的基因检出率检测。
33.图7 globin mrna阻碍探针组合物在lncrna
‑
seq中应用示意图。
[0034] 图8 qsep检测globin mrna阻碍探针组合物投入量在lncrna
‑
seq中对文库大小的影响。
[0035]
图9 globin mrna阻碍探针组合物投入量在lncrna
‑
seq中对文库产量的影响。
[0036]
图10 globin mrna阻碍探针组合物投入量在lncrna
‑
seq中的去除效率检测。
[0037]
图11 globin mrna阻碍探针组合物投入量在lncrna
‑
seq中的基因检出率检测。
[0038]
图12 逆转录阻碍探针组合物在超快速血液转录组测序中应用示意图。
[0039]
图13 qsep检测globin mrna阻碍探针组合物投入量在超快速血液转录组测序中对文库大小的影响。
[0040]
图14 globin mrna阻碍探针组合物投入量在超快速血液转录组测序中对文库产量的影响。
[0041]
图15 globin mrna阻碍探针组合物投入量在超快速血液转录组测序中的去除效率检测。
[0042]
图16 globin mrna阻碍探针组合物投入量在超快速血液转录组测序中的基因检出率检测。
[0043]
图17 qsep检测三种globin mrna和rrna去除建库方法对文库大小的影响。
[0044]
图18 三种globin mrna和rrna去除建库方法对文库产量的影响。
[0045]
图19 三种globin mrna和rrna去除建库方法的去除效率检测。
[0046]
图20 三种globin mrna和rrna去除建库方法的基因检出率检测。
[0047]
图21 三种globin mrna和rrna去除建库方法与rna直接建库测序数据相关性分析。
[0048]
图22 qsep检测不同血液rna投入量对超快速血液转录组建库的文库大小影响。
[0049]
图23不同血液rna投入量的超快速血液转录组测序数据的相关性分析。
具体实施方式
[0050]
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。
[0051]
实施例1
实施例1：globin mrna逆转录阻碍去除探针的设计和制备本发明实施例提供的globin mrna逆转录阻碍去除探针组合物，可以适用于多种高通量测序平台，如illumina、华大mgi
‑
seq、nanopore或者pacbio等，应用于转录组学和表观转录组学领域研究等检测范围，用于有效的去除血液样本rna中的globin mrna。
[0052]
探针组合物包括针对globin mrna分子全长序列设计合成的单链dna探针中的一种或多种的组合，探针序列及修饰见表1，globin mrna分子包括hba1 mrna（nm_000558.5）、hba2 mrna（nm_000517.6）、hbb mrna（nm_000518 .5）、hbg1 mrna（nm_000559.3）和hbg2 mrna（nm_000184.3）中的一种或者多种的组合。
[0053]
每条单链dna探针的长度为20nt
‑
23nt；相邻单链dna探针之间的长度间距小于50nt。
[0054]
每条探针3’端被nh2c6修饰封闭，中间含有多个位点的锁核酸修饰，50%的锁核酸位点位于探针5’端前三分之一的区域。
[0055]
每条探针自身互补值小于5，tm值大于80℃与非靶rna（rrna和globin mrna以外的rna）不超过连续15 nt的配对。
[0056]
根据以上条件，设计的globin mrna探针组合物包含20条探针，探针序列及修饰如表1所示。
[0057]
表1
所有探针用depc水溶解成20 μm终浓度，等体积混合且混合物中每条单链dna探针的浓度为1 μm。
[0058]
实施例2：mrna
‑
seq测序验证globin mrna逆转录阻碍探针组合物对模拟血液样本rna中globin mrna的去除效果。
[0059]
在本实施例中，我们利用mrna
‑
seq测序验证globin mrna逆转录阻碍探针组合物对制备的模拟血液总rna样本中globin mrna的去除效果（示意图见图2）。
[0060]
具体实施方式如下：1）模拟血液总rna标准品样本的制备。
[0061]
体外合成5’端带t7启动子和3’端带有30个腺苷酸（polya）的 globin cdna序列，使用thermo scientific的transcriptaid t7 高产率转录试剂盒（cat#k0441）按照说明书进行globin mrna的体外转录合成。
[0062]
表2组分用量globincdna1μg5
×
transcriptaidreactionbuffer4μlntpsmix8μltranscriptaidenzymemix2
µ
l补加depc水至20μl37℃反应2 h。
[0063]
加入1 μl dnase i（2 u/μl），37℃反应15 min。
[0064]
加入44 μl hieff ngs
®ꢀ
rna cleaner (yeasen, 12602)，充分吹打混匀，室温孵育5 min。
[0065]
将pcr管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。
[0066]
保持pcr管始终置于磁力架中，加入 200 μl nuclease free h2o新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。
[0067]
重复漂洗一次。
[0068]
用 10 μl移液器吸干净残留液体。
[0069]
保持 pcr 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠（5~10 min）。
[0070]
用52 μl depc水重悬磁珠，吹打混匀，室温静置5 min。
[0071]
将pcr管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），吸取50 μl globin mrna于新pcr管中。
[0072]
用nanodrop测定globin mrna浓度。
[0073]
取100 μg 293f细胞中提取的rna，加入10 μg 体外转录的globin mrna，即制备成含有9.1% globin mrna的模拟血液总rna标准品样本。
[0074]
2）mrna分离：1 μg模拟血液总rna使用翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
mrna isolation master kit（cat#12603）进行mrna分离。
[0075]
3）rna建库：使用翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
ultima dual
‑
mode rna library prep kit for illumina（cat#12252）进行rna ngs文库的构建。
[0076]
带有mrna（从1 μg血液总rna中分离得到）的oligodt磁珠按照下表溶液进行悬浮并处理。
[0077]
表2组分用量1μmglobinprobemixxμl2
×
frag/primebuffer8.5μl补加depc水至17μlx分别为0、0.2、0.5、1、2、4。
[0078]
吹打混匀后瞬离。
[0079]
95
ꢀ°
c 5 min，75
ꢀ°
c 1 min，55
ꢀ°
c 1 min，室温放置。
[0080]
表3组分用量
上述反应体系17μlstrandspecificityreagent6μl1ststrandenzymemix2μl总体积25μl按照翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
ultima dual
‑
mode rna library prep kit for illumina（cat#12252）的说明书进行二链合成、接头连接和pcr扩增。
[0081]
回收的文库用qubit定量后，用qsep检测文库的大小分布。
[0082]
获得的文库在illumina的novaseq 6000平台上进行测序。
[0083]
获得的测序结果比对到refseq人类标准转录组数据库中，计算测序数据中globin mrna数据的占比。
[0084]
结果见图3
‑
6。
[0085]
结果如图3
‑
图6所示，本专利设计的globin mrna逆转录阻碍探针可以在mrna
‑
seq过程中快速有效地去除模拟血液rna样本中的globin mrna。
[0086]
由图3和图4可知，加入globin mrna逆转录阻碍探针并不会明显影响文库的大小分布。
[0087]
但随着逆转录阻碍探针的投入量升高，文库产量会逐渐降低。
[0088]
这表明globin mrna逆转录阻碍探针确实能够有效地去除模拟血液rna样本中的globin mrna。
[0089]
测序结果分析见图5和图6。
[0090]
正常情况下1 μg模拟血液总rna样本中globin mrna占据总mrna含量的74.32%。
[0091]
加入globin mrna逆转录阻碍探针后globin mrna在总mrna中的占比显著降低。
[0092]
当1 μm globin mrna逆转录阻碍探针投入量达到1 μl时，1 μg模拟血液总rna中globin mrna在总mrna中的占比降至1.35%。
[0093]
当1 μm globin mrna逆转录阻碍探针投入量达到4 μl时，1 μg模拟血液总rna中globin mrna在总mrna中 的占比降至0.03%。
[0094]
从基因检出数上看，经逆转录阻碍探针法去除globin mrna后，模拟血液样本mrna
‑
seq的基因检出率有明显提升。
[0095]
这些结果表明本专利设计的globin mrna逆转录阻碍探针组合物可以有效去除模拟血液rna样本中的冗余globin mrna，在mrna
‑
seq中显著提高基因的检出率和检测成功率，降低检测的成本。
[0096]
实施例3：lncrna
‑
seq测序验证globin mrna逆转录阻碍探针组合物对模拟血液样本rna中globin mrna的去除效果。
[0097]
在本实施例中，我们利用lncrna
‑
seq验证globin mrna探针混匀物对模拟血液样本rna中globin mrna的去除效果（示意图见图7）。
[0098]
具体实施方式如下：1）rrna去除：1 μg模拟血液总rna使用翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
maxup rrna depletion kit（cat#12253）进行rrna去除。
[0099]
2）rna建库：使用翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
ultima dual
‑
mode rna library prep kit for illumina（cat#12252）进行rna ngs文库的构建。
[0100]
表4组分用量经上述方法去除核糖体的rna4μl1μmglobinprobemixxμl2
×
frag/primebuffer8.5μl补加depc水至17μlx分别为0、0.5、1、2。
[0101]
吹打混匀后瞬离。
[0102]
95
ꢀ°
c 5 min，75
ꢀ°
c 1 min，55
ꢀ°
c 1 min，室温放置。
[0103]
表5组分用量上述反应体系17μlstrandspecificityreagent6μl1ststrandenzymemix2μl总体积25μl按照翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
ultima dual
‑
mode rna library prep kit for illumina（cat#12252）的说明书进行二链合成、接头连接和pcr扩增。
[0104]
回收的文库用qubit定量后，用qsep检测文库的大小分布。
[0105]
获得的文库在illumina的novaseq 6000平台上进行测序。
[0106]
获得的测序结果比对到refseq人类标准转录组数据库中，计算测序数据中globin mrna数据的占比。
[0107]
结果见图8
‑
11。
[0108]
结果如图8
‑
图11所示，本专利设计的globin mrna逆转录阻碍探针可以在mrna
‑
seq过程中快速有效地去除模拟血液rna样本中的globin mrna。
[0109]
由图8和图9可知，globin mrna逆转录阻碍探针并不会显著影响文库的大小。
[0110]
随着逆转录阻碍探针的投入量升高，文库产量会逐渐降低。
[0111]
测序结果分析见图10和图11。
[0112]
正常情况下1 μg模拟血液总rna样本中globin mrna占据总lncrna含量的42.3%。
[0113]
加入globin mrna逆转录阻碍探针后globin mrna在总lncrna中的占比显著降低。
[0114]
当1 μm globin mrna逆转录阻碍探针投入量达到1 μl时，1 μg模拟血液总rna中globin mrna在总lncrna中的占比降至0.57%。
[0115]
当1 μm globin mrna逆转录阻碍探针投入量达到2 μl时，1 μg模拟血液总rna中globin mrna在总mrna中 的占比降至0.09%。
[0116]
从基因检出数上看，经逆转录阻碍探针法去除globin mrna后，模拟血液样本lncrna
‑
seq的基因检出率有明显提升。
[0117]
这些结果表明本专利设计的globin mrna逆转录阻碍探针组合物可以有效去除模拟血液rna样本中的冗余globin mrna，在lncrna
‑
seq中显著提高基因的检出率和检测成功率，降低检测的成本。
[0118]
实施例4： globin mrna和rrna逆转录阻碍探针组合物在2 min内对模拟血液样本
rna中globin mrna和rrna的快速去除效果。
[0119]
在本实施例中，我们结合本专利中的globin mrna转录阻碍探针组合物和之前的专利（202110257924 .x）中的rrna逆转录阻碍探针组合物，实现2 min内快速去除模拟血液样本rna中globin mrna和rrna的目的，我们将此方法命名为超快速血液转录组测序（superfast blood rna
‑
seq）。
[0120]
示意图见图12，具体实施方式如下：表6组分用量模拟血液总rna标准品1μg4μm5.8s/18s/28srrnaprobemix1μl1μmglobinprobemixxμl2
×
frag/primebuffer8.5μl补加depc水至17μlx分别为0、0.5、1、2吹打混匀后瞬离。
[0121]
95
ꢀ°
c 5 min，75
ꢀ°
c 1 min，55
ꢀ°
c 1 min，室温放置。
[0122]
表7组分用量上述反应体系17μlstrandspecificityreagent6μl1ststrandenzymemix2μl总体积25μl按照翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
ultima dual
‑
mode rna library prep kit for illumina（cat#12252）的说明书进行二链合成、接头连接和pcr扩增。
[0123]
回收的文库用qubit定量，用qsep检测文库的大小分布。
[0124]
获得的文库在illumina的novaseq 6000平台上进行测序。
[0125]
获得的测序结果比对到refseq人类标准转录组数据库中，计算测序数据中rrna和globin mrna数据的占比。
[0126]
结果见图13
‑
16。
[0127]
结果如图13
‑
图16所示，超快速血液转录组测序能够在2分钟内、快速有效地去除模拟血液rna样本中的globin mrna和rrna。
[0128]
由图13和图14可知，globin mrna逆转录阻碍探针并不会显著影响文库的大小。
[0129]
随着逆转录阻碍探针的投入量升高，文库产量会逐渐降低。
[0130]
测序结果分析见图10和图11。
[0131]
正常情况下1 μg模拟血液总rna样本中globin mrna占据总lncrna含量的45.62%。
[0132]
加入globin mrna逆转录阻碍探针后globin mrna在总lncrna中的占比显著降低。
[0133]
当1 μm globin mrna逆转录阻碍探针投入量达到1 μl时，1 μg模拟血液总rna中globin mrna在总lncrna中的占比降至0.46%。
[0134]
当1 μm globin mrna逆转录阻碍探针投入量达到2 μl时，1 μg模拟血液总rna中
globin mrna在总mrna中 的占比降至0.08%。
[0135]
此外，globin mrna逆转录阻碍探针不会对rrna逆转录阻碍探针的去除效率造成影响，加入rrna逆转录阻碍探针rrna的残留一直维持在0.5%左右。
[0136]
这说明globin mrna逆转录阻碍探针可以与rrna逆转录阻碍探针可以共同发挥快速去除globin mrna和rrna的作用。
[0137]
从基因检出数上看，经逆转录阻碍探针法去除globin mrna后，模拟血液样本lncrna
‑
seq的基因检出率有明显提升。
[0138]
这些结果表明超快速血液转录组测序技术能够显著简化去除globin mrna和rrna的操作，提高基因的检出率和降低测序的成本。
[0139]
实施例5： 三种globin mrna去除方式效率的对比。
[0140]
在本实施例中，我们对比了本发明开发的超快速转录组测序技术和市面上两种已有的去除rrna和globin mrna的技术，一种是epicentre公司开发的利用生物素标记的dna探针对rrna和globin mrna进行捕获分离的技术（捕获分离法），产品为globin
‑
zero gold rrna移除试剂盒（cat#gzg1206）；另一种是new england biolabs公司开发的利用dna探针和rnase h消解靶rna的技术（rnase h切割去除法），产品为nebnext globin & rrna 去除试剂盒（cat# e7755）；三种方法示意图见图1，具体实施方式如下：1、超快速转录组测序技术流程：表8组分用量模拟血液总rna1μg4μm5.8s/18s/28srrnaprobemix1μl1μmglobinprobemix1μl2
×
frag/primebuffer8.5μl补加depc水至17μl吹打混匀后瞬离。
[0141]
95
ꢀ°
c 5 min，75
ꢀ°
c 1 min，55
ꢀ°
c 1 min，室温放置。
[0142]
表9组分用量上述反应体系17μlstrandspecificityreagent6μl1ststrandenzymemix2μl总体积25μl按照翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
ultima dual
‑
mode rna library prep kit for illumina（cat#12252）的说明书进行二链合成、接头连接和pcr扩增。
[0143]
2、捕获分离法rna建库流程：1）rrna和globin mrna的去除：取1 μg模拟血液总rna，按照new england biolabs公司的globin
‑
zero gold rrna移除试剂盒（cat#gzg1206）的说明书进行操作。
[0144]
9 μl depc水洗脱磁珠上的rna。
[0145]
2）一链cdna合成：
表10组分用量回收的rna8.5μl2
×
frag/primebuffer8.5μl总体积17μl吹打混匀后瞬离。
[0146]
95
ꢀ°
c 5 min，4℃放置。
[0147]
表11组分用量上述反应体系17μlstrandspecificityreagent6μl1ststrandenzymemix2μl总体积25μl按照翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
ultima dual
‑
mode rna library prep kit for illumina（cat#12252）的说明书进行二链合成、接头连接和pcr扩增。
[0148]
3、rnase h切割去除法rna建库流程：1）rrna和globin mrna的去除：取1 μg模拟血液总rna，按照epicentre公司的nebnext globin & rrna 去除试剂盒（cat# e7755）的说明书进行操作。
[0149]
9 μl depc水洗脱磁珠上的rna。
[0150]
2）一链cdna合成：表12组分用量回收的rna8.5μl2
×
frag/primebuffer8.5μl总体积17μl吹打混匀后瞬离。
[0151]
95
ꢀ°
c 5 min，4℃放置。
[0152]
表13组分用量上述反应体系17μlstrandspecificityreagent6μl1ststrandenzymemix2μl总体积25μl按照翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
ultima dual
‑
mode rna library prep kit for illumina（cat#12252）的说明书进行二链合成、接头连接和pcr扩增。
[0153]
回收的文库用qubit定量，用qsep检测文库的大小分布。
[0154]
获得的文库在illumina的novaseq 6000平台上进行测序。
[0155]
获得的测序结果比对到refseq人类标准转录组数据库中，计算测序数据中globin mrna和rrna数据的占比。
[0156]
结果见图17
‑
21。
[0157]
结果如图17
‑
21所示，三种去除血液globin mrna和rrna的建库方法与rna直接建库的文库大小相似，但超快速血液转录组测序方法的文库产量、去除效果和基因检出数要明显高于其他两种去除血液globin mrna和rrna的建库方法（捕获分离法转录组测序和rnase h切割法转录组测序），这说明超快速血液转录组测序方法具有损失小、操作简单、去除效率高和基因检出率高等优点。
[0158]
相关性分析结果显示相比于另外两种去除血液globin mrna和rrna的建库方法，超快速血液转录组测序方法与rna直接建库测序方法具有更好的相关性，这表明超快速血液转录组测序方法具有更小的偏好性，更能反映出原始rna样本的真实转录组状态。
[0159]
实施例6： 超快速血液转录组测序对不同模拟血液rna投入量的检出效果。
[0160]
在本实施例中，我们验证了超快速血液转录组测序对不同血液rna投入量的检出效果。
[0161]
具体实施方式如下：表14组分用量模拟血液总rnaxng4μm5.8s/18s/28srrnaprobemix1μl1μmglobinprobemix1μl2
×
frag/primebuffer8.5μl补加depc水至17μlx分别为0.01、0.1、1、10、100、1000吹打混匀后瞬离。
[0162]
95
ꢀ°
c 5 min，75
ꢀ°
c 1 min，55
ꢀ°
c 1 min，室温放置。
[0163]
表15组分用量上述反应体系17μlstrandspecificityreagent6μl1ststrandenzymemix2μl总体积25μl按照翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
ultima dual
‑
mode rna library prep kit for illumina（cat#12252）的说明书进行二链合成、接头连接和pcr扩增。
[0164]
回收的文库用qubit定量，用qsep检测文库的大小分布。
[0165]
获得的文库在illumina的novaseq 6000平台上进行测序。
[0166]
获得的测序结果比对到refseq人类标准转录组数据库中，计算测序数据中rrna和globin mrna数据的占比。
[0167]
结果见表16和图22、23。
[0168]
表16rna投入量/ng循环数产量/ngrrna+globinmrna占比基因检出数0.01242054.3%4953
0.1203131.9%86911175230.8%14627101311070.3%191041001016580.2%229761000824730.5%24739结果如表16和图22、23所示，超快速血液转录组测序对于10 pg(单细胞rna量)
‑
1000 ng的rna投入量都具有很好的globin mrna和rrna去除效果、文库产量和基因检出数。
[0169]
且对于不同投入量的模拟血液样本rna，超快速血液转录组测序结果具有良好的相关性。
[0170]
这些结果表明利用逆转录阻碍探针法去除globin mrna和rrna的超快速血液转录组测序技术能够适用于低质量低浓度的血液rna样本，克服了传统globin mrna和rrna去除方法无法检测10 ng以下的血液rna样本的弊端，提高了检测的灵敏性和成功率。