用于检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测溶血性曼氏杆菌的环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)引物及方法。

技术背景

溶血性曼氏杆菌(mannheimiahaemolytica,m.h)是引起牛羊等反刍动物呼吸疾病综合征(bovinerespiratorydiseasecomplex,brd)的病原之一，当运输、环境等应激或其他病原协同感染导致宿主抵抗力下降时，病原侵袭肺部引起疾病发生，对牛场养殖造成巨大的损失。尽管较多血清型菌株均能引起发病，但从全球感染溶血性曼氏杆菌的动物来看，a1、a2和a6血清型占主导地位，a1和a6血清型主要感染牛，而a2血清型主要感染羊。有研究表明白细胞毒素(leukotoxin,lkt)亚单位疫苗可以有效提高免疫保护力。

已有的溶血性曼氏杆菌的诊断方法主要为实验室进行细菌培养、pcr、多重pcr和pcr-elisa等方法。这些方法对实验条件的要求、检测时间能及本身的灵敏度等方面均具有一定的局限性。因此，临床上急需一种高灵敏度和特异性、操作简单快速和能在现场检测的方法来弥补现有方法的不足。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是一种具有灵敏、特异、快速、简单、成本低等优点的核酸扩增方法。在溶血性曼氏杆菌检测方面，已有使用lamp方法进行检测的报道(cn108660192a)，该方法针对溶血性曼氏杆菌gcp基因设计引物，进行环介导等温扩增并根据实时浊度仪进行结果判定，能够检测到0.855×10^-4ng/μl的gcp基因重组质粒，然而对病毒的检测灵敏度仍较低。

另外，浊度检测需要电脑和浊度仪等特殊的仪器，而且浊度的测定有一定的误差，不利于现场的操作。因此本研究的目的是在现有环介导等温扩增的基础上，基于溶血性曼氏杆菌保守基因lktc设计引物，建立一步法可视化lamp方法，用于提高溶血性曼氏杆菌的检测灵敏度和便利性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测溶血性曼氏杆菌的lamp引物及方法，旨在提高溶血性曼氏杆菌的检测灵敏度和便利性。

为了实现上述目的，本发明针对溶血性曼氏杆菌的lktc基因，设计了用于检测溶血性曼氏杆菌的lamp引物组，该引物组能够特异性扩增溶血性曼氏杆菌的lktc基因(seqidno.6)，所述引物组包括2条内引物、2条外引物和1条环引物，核苷酸序列如下：

内引物：fip:5'–ttgttgcagcagggcaggagcgaccagttagataaccatagcg-3'(seqidno.1)

内引物:bip:5'–aaccagagcggtggcctctaaggtggtgttgttacgactg-3'(seqidno.2)

外引物:f3:5'-caatcgcatccgggctaa-3'(seqidno.3)

外引物:b3:5'-tccggtacggttcagcaa-3’(seqidno.4)

环引物:lb:5'-catcgtcttccggcacaa-3'(seqidno.5)

上述引物用于检测溶血性曼氏杆菌，所使用的检测方法是可视化lamp检测方法。该方法以溶血性曼氏杆菌总dna为模板，溶血性曼氏杆菌lktc基因(genbank登录号：cp017484.1)构建的重组质粒puc57-m.haemolytica-lktc为阳性对照，无菌双蒸水为阴性对照，用seqidno.1-5所示的引物对溶血性曼氏杆菌进行可视化lamp检测，通过sybrgreenⅰ染料颜色的变化进行判断。若待测样品和阳性对照均由无色变为荧光绿色，而阴性对照由无色变为橙色，则表明待测样品中含有溶血性曼氏杆菌；若待测样品和阴性对照由无色变为橙色，而阳性对照由无色变为荧光绿色，则表明待测样品中不含有溶血性曼氏杆菌。

溶血性曼氏杆菌lktc基因主要功能为编码酰基化lkta蛋白，向c端延伸后有一个高度保守且富含甘氨酸和天冬氨酸重复的九肽序列区域，该区域内含钙离子结合位点以及白细胞cd18分子的配体，是lkta发挥细胞毒性必不可少的功能区域。本发明选用白细胞毒素基因(lktc)作为靶标基因，该序列具有高度保守性和特异性，通过扩增该序列可以判断感染的溶血性曼氏杆菌是否含有溶血性曼氏杆菌lktc基因。

其中所述的可视化lamp反应体系为：

所述lamp扩增的反应温度为68.2℃。

本发明的有益效果是：

本发明在普通lamp技术的基础上，根据溶血性曼氏杆菌lktc基因设计了5条引物，反应体系中加入sybrgreenⅰ染料，通过反应管中颜色的变化，建立了可视化lamp检测方法。与普通pcr和荧光定量pcr相比，可视化lamp反应时间短，在1h内可以完成；不需要复杂的仪器，只需要一个水浴锅；成本与其他方法相比较低。此方法检测培养物的分析灵敏度为0.67cfu/μl，检测质粒的分析灵敏度为2.5×10^-6ng/μl，均高于现有方法，检测人工感染肺组织样本的诊断敏感性为100％(95％ci：78.2％，100.0％)，高于普通pcr方法。本发明可望应用于试剂盒制备，在动物呼吸疾病综合征的临床诊断以及非诊断目的的病原实验室筛查中发挥重要作用。

附图说明

图1不同温度与荧光信号关系。

图2不同mgso4浓度与荧光信号关系。

图3不同dntps浓度与荧光信号强度关系。

图4不同环引物浓度与荧光信号关系。

图5可视化lktc-lamp特异性验证结果。

图6可视化lktc-lamp检测溶血性曼氏杆菌灵敏度结果。

图7可视化gcp-lamp检测溶血性曼氏杆菌灵敏度结果。

图8可视化lktc-lamp检测lktc质粒灵敏度结果。

图9pcr检测溶血性曼氏杆菌灵敏度结果。

图10pcr检测质粒灵敏度结果。

图11普通pcr和可视化lktc-lamp检测检测阴性小鼠肺组织结果。

图12普通pcr和可视化lktc-lamp检测人工感染小鼠阳性肺组织结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：溶血性曼氏杆菌lktc-lamp检测方法的建立及优化

取1μl插入溶血性曼氏杆菌lktc基因(genbank登录号：cp017484.1)的重组质粒puc57-m.haemolytica-lktc的dna作为模板，按照表2配制的体系，以无菌双蒸水作为阴性对照。通过控制变量法改变单一变量的条件变化时，通过改变无菌双蒸水的体积来平衡反应体系。

表1可视化lktc-lamp反应初始体系

反应液配置完成后，用30μl液体石蜡油进行封闭，然后在反应管管盖上滴0.2μlsybrgreenⅰ染料，最后在恒温水浴锅中进行反应。

1.1引物的设计

利用在线软件primerexplorerv5设计出一组特异性引物序列如下：

内引物：fip:5'–ttgttgcagcagggcaggagcgaccagttagataaccatagcg-3'(seqidno.1)

内引物:bip:5'–aaccagagcggtggcctctaaggtggtgttgttacgactg-3'(seqidno.2)

外引物:f3:5'-caatcgcatccgggctaa-3'(seqidno.3)

外引物:b3:5'-tccggtacggttcagcaa-3’(seqidno.4)

环引物:lb:5'-catcgtcttccggcacaa-3'(seqidno.5)

1.2重组质粒的构建

根据引物所扩增序列构建重组质粒puc57-m.haemolytica-lktc，质粒载体选择puc57质粒，构建方法为本领域常规方法。

1.3反应条件的优化

1.3.1温度的优化

在25μl体系中，对温度梯度进行优化，梯度设置为60.6℃，62.5℃，65.0℃，67.0℃和68.2℃，不同温度下的荧光强度如图1所示。根据ct值和不同荧光信号强度进行判断，在扩增温度为68.2℃时ct值最小为12.41，选择68.2℃为可视化lamp反应的最佳温度。

表2不同温度与ct值的关系

1.3.2mgso4浓度的优化

在25μl体系中，对mg²⁺浓度进行优化，梯度设置为0mm、2mm、4mm、6mm、8mm和10mm，不同浓度下的荧光强度如图2所示。根据ct值和不同荧光信号强度进行判断，在浓度为6mm(1.5μl)时ct值最小为16.12，选择6mm为可视化lamp反应的最佳mg²⁺浓度。

表3不同mgso4浓度与ct值的关系

1.3.3dntps浓度的优化

在25μl体系中，对dntp浓度进行优化，梯度设置为0.6mm、0.8mm、1.0mm、1.2mm、1.4mm和1.6mm,不同浓度下的荧光强度如图3所示。根据ct值和不同荧光信号强度进行判断，在浓度为1.6mm(4.0μl)时ct值最小为11.52，选择1.6mm为可视化lamp反应的最佳dntp浓度。

表4不同dntps浓度与ct值的关系

1.3.4环引物浓度的优化

在25μl体系中，对环引物浓度进行优化，梯度设置为0μl、0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl和2.5μl，不同浓度下的荧光强度如图4所示。根据ct值和不同荧光信号强度进行判断，在浓度为1.0μl时ct值最小为32.58，选择1.0μl为可视化lamp反应的最佳环引物浓度。

表5不同环引物浓度与ct值的关系

综上所述：本发明设计了一套lktc基因的特异性引物，并建立了溶血性曼氏杆菌lktc基因的可视化lamp方法，其最佳反应体系(25μl)如下：2.5μl10×isothermalamplificationbuffer，1.5μlmgso4，4.0μldntps，4.0μl内引物fip，4.0μl内引物bip，0.5μl外引物f3，0.5μl外引物b3，1.0μl环引物lb，1μlbst2.0聚合酶，1μldna模板，5μlddh2o。体系配好后在液体上方添加液体石蜡30μl，反应管管盖贴壁滴加0.2μlsybrgreenⅰ染料，68.2℃水浴锅孵育40min。

实施例2：特异性和敏感性检测

2.1特异性分析

以溶血性曼氏杆菌a1、溶血性曼氏杆菌a2、溶血性曼氏杆菌a6、多杀性巴氏杆菌a型、多杀性巴氏杆菌b型、多杀性巴氏杆菌f型、牛支原体、沙门氏菌、大肠杆菌、副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛传染性鼻气管炎病毒为阳性模板，以ddh2o为阴性模板进行可视化lamp特异性验证。根据优化好的最终体系反应，阳性结果呈现荧光绿色，阴性结果为橙黄色。结果如图5所示，特异性良好，只能检测出溶血性曼氏杆菌a1、a2和a6。

2.2敏感性分析

以溶血性曼氏杆菌dna为模板，双蒸水为阴性对照进行基于细菌的可视化lamp和普通pcr敏感性分析。可视化lktc-lamp对菌液的灵敏度检测限为6.7×10^-1cfu/μl(图6)；通过gcp基因引物(cn108660192a)进行可视化gcp-lamp对菌液的灵敏度检测限为6.7cfu/μl(图7)；普通pcr方法对菌液的灵敏度检测限为6.7cfu/μl(图9)。针对gcp基因对菌液的检测灵敏度与普通pcr方法相同，而针对lktc基因对菌液的检测灵敏度比普通pcr方法高10倍。

以lktc质粒作为dna作模板，双蒸水为阴性对照进行基于质粒的可视化lktc-lamp和普通pcr敏感性分析。可视化lktc-lamp对质粒的灵敏度检测限为2.5×10^-6ng/μl(图8)；普通pcr方法对质粒的灵敏度检测限为2.5×10^-5ng/μl(图10)。与gcp-lamp质粒的灵敏度检测限0.855×10^-4ng/μl(cn108660192a)相比，可视化lktc-lamp检测质粒的灵敏度比gcp-lamp方法高约1000倍。

实施例3可视化lktc-lamp实用性检测

为了进一步验证可视化lamp的实用性，用可视化lktc-lamp和普通pcr方法同时检测已知背景的小鼠肺组织，包括阴性小鼠肺组织样本和溶血曼氏杆菌人工感染7天、pcr鉴定阳性的肺组织阳性样本各15份。可视化lktc-lamp和普通pcr方法对阴性组织的检测结果如图11所示，阴性组织两种方法全部检测为阴性，表明两种方法的诊断特异性良好，均为100％(95％ci：78.2％，100.0％)。可视化lktc-lamp和普通pcr方法对阳性组织的检测结果如图12所示，普通pcr检出10份阳性和5份阴性，诊断敏感性为66.7％(95％ci：38.4％，88.2％)，而可视化lktc-lamp检测出15份阳性和0份阴性，诊断敏感性为100％(95％ci：78.2％，100.0％)，两种方法的诊断敏感性通过卡方检验，差异显著(p<0.05)。综上，可视化lktc-lamp有很高的诊断敏感性和诊断特异性，从而在溶血性曼氏杆菌可视化现场快检领域具有很好的应用前景。

序列表

<110>华中农业大学

<120>用于检测溶血性曼氏杆菌的lamp引物组及方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>43

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>溶血性曼氏杆菌(mannheimiahaemolytica)

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tagattcttcctatctatagctatagttgcattaaaaactaagcctacattaggttgttc180

aatcgcatccgggctaatatgtttaattcgaccagttagataaccatagcgtgtataagg240

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cggtgctctgatcatcgaggcctgtc446