一种用于制备(S)-3,4-二羟基-2’-氯苯乙醇的酮还原酶突变体的制作方法

一种用于制备(s)-3,4-二羟基-2
’‑
氯苯乙醇的酮还原酶突变体
技术领域：
1.本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种酮还原酶突变体，可以用于制备去s-去甲肾上腺素和s-肾上腺素的中间体(s)-3,4-二羟基-2
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氯苯乙醇。


背景技术：

2.去甲肾上腺素，化学名(r)-4-(2-氨基-1-羟基乙基)-1,2-苯二酚，是肾上腺素去掉n-甲基后形成的物质，在化学结构上也属于儿茶酚胺。去甲肾上腺素是一种抗休克的血管活性药，主要用于抢救急性低血压和周围血管扩张所引起的休克等。
3.去甲肾上腺素中具有旋光性，左旋体疗效较右旋体大27倍，因此，r型去甲肾上腺素在临床上广泛应用于抢救急性低血压和周围血管扩张所引起的休克等。r型去甲肾上腺素的生产制备、质量分析及相关的生物体实验中，s型去甲肾上腺素分子起到重要的标样或对照实验的作用。而目前并没有专用于s型去甲肾上腺素的合成工艺，而是借助于原有的r型去甲肾上腺素合成路线，通过外消旋去甲肾上腺素分子的拆分，制备出s型去甲肾上腺素光学异构体。并且随着s型去甲肾上腺素在临床研究中的不断推进，亦进一步扩大了s型去甲肾上腺素的市场需求。但随着去甲肾上腺素合成工艺的改进，越来越多的生产厂家采用不对称合成方法，直接制备出r型去甲肾上腺素，无法通过拆分的方法得到s型去甲肾上腺素，导致s型去甲肾上腺素产出减少，供应价格升高。
4.根据现有报道制备去甲肾上腺素的工艺方法可以看出，利用scheme1所示的合成路线可以制备s型去甲肾上腺素的方法最为简洁，但前提是需要解决(s)-3,4-二羟基-2
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氯苯乙醇的制备工艺问题。
[0005][0006]
另外，(s)-3,4-二羟基-2
’‑
氯苯乙醇也是制备(s)-肾上腺素的重要中间体。
[0007]
综上所述，目前亟需一种高效制备手性化合物(s)-3,4-二羟基-2
’‑
氯苯乙醇的工艺，满足不断增长的市场需求，其中关键在于酮还原酶的选择。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的酮还原酶突变体。
[0009]
一方面，本发明利用蛋白质工程技术对来源于lactobacillus kefiri的酮还原酶进行半理性和理性的设计，在高通量的筛选作用下，获得2个高催化效率的酮还原酶突变体mut1和mut2。
[0010]
进一步，所述酮还原酶突变体mut1和mut2的氨基酸序列分别如seq id no.3和5所示。
[0011]
更进一步，所述酮还原酶突变体mut1是在野生型序列基础上将部分位点进行突变，具体突变为：第14位点为ala，第72位点为phe，第94位点为thr，第116位点为ile，第143位点为ser，第147位点为leu，第156位点为tyr，第160位点为lys，第199位点为his，第202位点为leu，第237位点为pro。
[0012]
更进一步，所述酮还原酶突变体mut2是在酮还原酶突变体mut1的序列基础上进行取代、缺失获得。
[0013]
更进一步，所述酮还原酶突变体来源于野生型lactobacillus kefiri，野生型模板ncbi的登录号为4rf2_a。
[0014]
进一步，所述酮还原酶突变体在体外构建到重组表达载体上，优选pet系列载体。
[0015]
进一步，所述酮还原酶突变体的宿主细胞为大肠杆菌，所述细胞为bl21(de3)、plyss或origami b(de3)。
[0016]
进一步，经过宿主细胞的在iptg诱导下的表达后，可以获得两株突变体的蛋白。在高浓度的异丙醇参与下，利用全细胞也实现了高浓度底物的催化。
[0017]
另一方面，本发明提供的酮还原酶突变体可以将3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮转化为(s)-3,4-二羟基-2
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氯苯乙醇，采用的技术方案如下：
[0018][0019]
进一步，所述3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮浓度可达200g/l。
[0020]
进一步，所述酮还原酶突变体为酮还原酶酶粉或含有该酮还原酶的全细胞或细胞破碎液，优选酮还原酶全细胞。
[0021]
进一步，所述反应中需要加入辅酶体系，优选nadph，浓度小于0.1mm。
[0022]
进一步，所述反应利用酮还原酶突变体的逆向反应，以异丙醇为底物实现了辅酶nadph的再生。
[0023]
更进一步，所述反应中异丙醇的浓度控制在20％～80％之间，优选80％。
[0024]
进一步，所述反应的反应温度控制在25～45℃，优选37℃。
[0025]
进一步，所述反应的ph控制在5.0～7.5之间，优选6.0。
[0026]
本发明的有益效果在于，本发明提供了一种新的酮还原酶突变体，转化底物浓度高达200g/l，转化率95.5％以上，手性ee值》99％。反应工艺简单、成本低、污染小，可选择性获得s-肾上腺素和s-去甲肾上腺素。
附图说明
[0027]
无
具体实施方式
[0028]
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
[0029]
实施例1酮还原酶kred突变库的构建
[0030]
以seq id no.1(对应的核苷酸序列为seq id no.2)野生型酮还原酶的结构作为参考，通过计算机模拟，分别将其与底物和s性产物进行对接，获得结构和能量上的最佳。为了让s性产物能够在酮还原酶kred的活性口袋中更好的存在，我们对产生空间位阻的氨基酸进行了饱和突变筛选，构建出了11000个单克隆的库容量。通过对这些位点进行饱和引物设计，在高保真聚合酶的参与下，实现重组质粒pet-21a-kred的全质粒扩增反应，接着利用fd dpni限制性内切酶对pcr产物进行模板消化，再经纯化后，转入大肠杆菌bl21(de3)感受态，然后加入1ml的lb培养基进行37℃的孵育，之后将其涂布于含有50ug/l amp
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的lb固体平板上，在37℃的培养箱中倒置培养18h长出满板的单克隆，这些平板即为构建的突变库，为后期筛选所用。
[0031]
实施例2酮还原酶kred突变体的筛选
[0032]
从每个平板上随机挑取188个单克隆进行96孔板振荡培养，每个96孔板接种两个孔为野生型的菌种，用于后期分析作为对照组，共计20块96孔板。具体操作为：在无菌的96孔板中加入400ul的lb培养基，37℃培养约12h，按照10％的接种量，转接于第二个96孔板中培养，继续培养约3h，加入终浓度为0.1mm的iptg诱导表达16h，诱导温度25℃。培养结束后离心弃上清，冻存于-20℃冰箱中待用。
[0033]
按照表1配制转化体系，用排枪吸取300ul转入上述离心后的96孔板中，在37℃的恒温振荡器中，300rpm的转速下反应4h(此为对照组转化约一半底物的反应时间)，80℃失活。最后对所有转化反应液进行340nm下的吸光光度检测和手性hplc的分析，将催化效率和手性值都提升在10％以上的作为阳性，并测序分析突变体信息，在此突变的基础上进行下次迭代突变，以此类推，逐渐完成所有位点的迭代饱和突变，将最终的高催化活性和手性选择性的突变体作为本次进化的最佳结果。
[0034]
表1筛选饱和突变体库的反应液体系
[0035]
原料浓度底物20g/l异丙醇20％nadh2g/lph 7.0磷酸钾buffer100mm
[0036]
实施例4酮还原酶的重组表达
[0037]
将前期筛选的阳性突变菌株进行扩大发酵制备，首先把含有目的基因的bl21(de3)细胞接种到含有amp
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抗性的lb试管中，于37℃培养过夜，得到一级种子培养液。将种子培养液按照1％的接种比例转接到含有抗性的2yt液体培养基中，置于摇床中，37℃下，200rpm转速培养3-5h，测od达到0.6～0.8时，降温至20℃，加入iptg，浓度控制在0.1mm，进行隔夜诱导表达。发酵液通过离心并收集菌体，用20mm tris-hcl缓冲液(ph 6.5)将收集的菌体进行溶解，并利用超声破碎细胞。之后再用12000rpm离心10min，得到的上清液即为转氨酶蛋白，通过电泳可以看见蛋白的表达情况。
[0038]
实施例4野生型酮还原酶的催化反应
[0039]
向50ml反应瓶中加入0.2g 3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮，用4ml异丙醇溶解，加入6mg的辅酶nadph，加入16ml水，用0.1m的naoh调ph至7.0，最后投入1g细胞(含有野生型酮还原酶)。在37℃水浴中搅拌反应，利用0.1m的naoh控制反应过程中ph在6.0～7.5之间。24h反应结束后，用2倍的乙腈溶解，进行hplc分析，转化率为65％。40℃下旋转蒸干后得到目标产物，ee值仅有45％。
[0040]
实施例5酮还原酶突变体mut1的催化反应
[0041]
向50ml反应瓶中加入4g 3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮，用16ml异丙醇溶解，加入6mg的辅酶nadph，加入4ml水，用0.1m的氢氧化钠溶液调ph至6.5，最后投入1g酮还原酶酶粉(突变体mut1)。在37℃水浴中搅拌反应，利用0.1m的氢氧化钠溶液控制反应过程中ph在6.0～7.5之间。24h反应结束后，用2倍的乙腈溶解，进行hplc分析，转化率为95％。40℃下旋转蒸干后得到目标产物，ee值为99％。
[0042]
实施例6酮还原酶突变体mut2的催化反应
[0043]
向50ml反应瓶中加入4g 3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮，用16ml异丙醇溶解，加入6mg的辅酶nadph，加入4ml水，用0.1m的氢氧化钠溶液调ph至6.5，最后投入1g细胞(含酮还原酶突变体mut2)。在37℃水浴中搅拌反应，利用0.1m的氢氧化钠溶液控制反应过程中ph在6.0～7.5之间。24h反应结束后，用2倍的乙腈溶解，进行hplc分析，转化率为99％。40℃下旋转蒸干后得到目标产物，ee值为99％。