一种增菌液及其在检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中的用途的制作方法

1.本发明涉及食品微生物安全监测领域，具体涉及一种增菌液及其在检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)中的用途。


背景技术：

2.椰毒假单胞菌酵米面亚种是一类革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，最适生长温度37℃，最适ph 5～6，于1999年被划分为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的一个病原型，存在于谷物类发酵制品、变质银耳和木耳等食品中。菌株产米酵菌酸毒素，该毒素致死率高达40％～100％，至今没有文献报道相关有效解毒药。米酵菌酸在人体内主要通过消化道粘膜吸收，经过血液循环进入到身体，主要的靶器官是肝、脑、肾等器官，发病急，潜伏期多数为2～24h。
3.唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)常用的检测方法是国家标准《gb 4789.29-2020食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检验》，该方法采用gvc增菌液进行增菌，改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基(mpda)和pcfa培养基进行选择性分离。日常检测过程中发现，样品经过gvc增菌液增菌后增菌液表层会出现一层白色菌膜，该菌膜由细菌和霉菌组成；同时增菌后的菌悬液划线在分离平板mpda培养基中出现非目标菌多、目标菌菌落特征不明显等现象，主要表现为：非目标细菌蔓延生长，菌落呈粘稠状，在mpda培养基上覆盖平板，掩盖唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的生长；霉菌蔓延生长，覆盖目标菌株，不利于挑取目标菌；目标菌菌落较小、形态不典型如干燥以及目标菌量少等，加大了目标菌分离鉴定的难度。对近上千份样品的检测过程中发现经过gvc增菌液增菌和mpda培养基分离出的主要非目标菌种类如下：假单胞菌属，如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、食油假单胞菌；肠杆菌属，如霍氏肠杆菌；分散泛菌，解甘露醇罗尔斯顿菌和真菌类如霉菌等。这些非目标菌的存在，一方面会抢夺营养物质，一定程度影响目标菌的生长繁殖；另一方面会加大可疑菌落挑取难度，甚至出现有些目标菌被杂菌覆盖而无法观察的情况，严重影响检出率和工作效率。


技术实现要素：

4.根据第一方面，在一实施例中，提供一种增菌液，所述增菌液含有如下组分：马铃薯葡萄糖水溶液、龙胆紫、氯霉素、多黏菌素b、脱氢乙酸钠。
5.根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面所述增菌液的制备方法，包括：按配方量将马铃薯葡萄糖水溶液、龙胆紫、氯霉素、多黏菌素b、脱氢乙酸钠混合，制得所述增菌液。
6.根据第三方面，在一实施例中，提供第一方面所述增菌液在检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)中的用途。
7.根据第四方面，在一实施例中，提供第一方面所述增菌液在筛选唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)中的用途。
8.根据第五方面，在一实施例中，提供第一方面所述增菌液在培养唐菖蒲伯克霍尔
gladioli(pseudomonas cocovenenans subsp.farino fermentans)。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)为革兰氏阴性菌。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生化特征差异极微(参考文献1：范璐，栾杰，云南省一例唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)食物中毒事件调查分析，食品安全质量检测学报，第10卷第23期，2019年12月；参考文献2：林捷，方陈玉，陆晶芳等，食品中椰毒假单胞菌酵米亚种实时荧光pcr检测的研究，食品安全质量检测学报，第11卷第11期，2020年6月；参考文献3：焦振泉，曹玮，余东敏等，椰毒假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌16s～23srrna基因间区序列的比较研究，中国食品卫生杂志，2008年第20卷第3期)。
20.多黏菌素b亦称多粘菌素b，多黏菌素b主要对部分革兰阴性菌有抑制作用。本发明中，多黏菌素b具有抑制非目标菌(即唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)之外的微生物)生长繁殖的作用。
21.脱氢乙酸钠，又名脱氢醋酸钠，脱氢乙酸钠可抑制真菌如酵母菌、霉菌的生长繁殖。
22.龙胆紫亦称甲紫、结晶紫，龙胆紫对部分革兰氏阳性菌如葡萄球菌、白喉杆菌，以及绿脓杆菌、白念珠菌、表皮癣菌等有杀灭作用，对其他革兰氏阴性菌和抗酸菌几乎无作用。
23.氯霉素是一种抗生素，对部分革兰阳性、阴性细菌有抑制作用。
24.龙胆紫、氯霉素、多黏菌素b、脱氢乙酸钠以及制备马铃薯葡萄糖水溶液所用的马铃薯、葡萄糖等原料均可从市场上购买得到。
25.在一实施例中，本发明的增菌液选择性增殖的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌通常包括产米酵菌酸的菌株、不产米酵菌酸的菌株中的至少一种。通常，在使用本发明的增菌液选择性增殖出食物样品中的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌之后，再进行后续的菌种鉴定、毒性试验。
26.在一实施例中，所述多黏菌素b在所述增菌液中的浓度≥5μg/ml。在能够起到有效抑制非目标菌的情况下，通常选择尽量低的多黏菌素b浓度，以控制成本，本发明中，增菌液中多黏菌素b的浓度最低可以为5μg/ml。
27.在一实施例中，所述脱氢乙酸钠在所述增菌液中的浓度≥0.01wt％。
28.在一实施例中，所述增菌液含有如下浓度的组分：5～20μg/ml多黏菌素b、0.01～0.03wt％脱氢乙酸钠。所述增菌液中多黏菌素b的浓度可以包括但不限于5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml等等，脱氢乙酸钠的浓度包括但不限于0.01wt％、0.02wt％、0.03wt％等等。前述各浓度均是指多黏菌素b、脱氢乙酸钠在增菌液中的终浓度。
29.在一实施例中，所述增菌液含有如下浓度的组分：多黏菌素b10μg/ml、脱氢乙酸钠0.03wt％。
30.在一实施例中，所述增菌液含有如下浓度的组分：10μg/ml龙胆紫、20μg/ml氯霉素。
31.在一实施例中，所述马铃薯葡萄糖水溶液(亦称pd水)是由马铃薯、葡萄糖与水混合后，加热煮沸制得。
32.在一实施例中，所述马铃薯葡萄糖水溶液的制备方法如下：将马铃薯与水混合后，加热煮沸，然后加入葡萄糖，制得所述马铃薯葡萄糖水溶液。
33.在一实施例中，煮沸后，保持10min～20min。
34.在一实施例中，每1000ml水中加有300g马铃薯(去皮)、20g葡萄糖。
35.在一实施例中，通常是将去皮的马铃薯切成碎块，加入水(例如1000ml)中，煮沸10min～20min，用纱布过滤，补加水至初始体积(例如1000ml)，然后加入葡萄糖，加热溶化，得到所述马铃薯葡萄糖水溶液。通常是将所述马铃薯葡萄糖水溶液进行高压灭菌(121℃高压20min)，冷却后用于配制增菌液。
36.在一实施例中，所述马铃薯通常是去皮后的马铃薯。
37.在一实施例中，所述水包括但不限于蒸馏水。
38.在一实施例中，所述马铃薯葡萄糖水溶液的ph为7.0
±
0.2。
39.在一实施例中，所述增菌液为可选择性增殖唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的增菌液。
40.根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面所述增菌液的制备方法，包括：按配方量将马铃薯葡萄糖水溶液、龙胆紫、氯霉素、多黏菌素b、脱氢乙酸钠混合，制得所述增菌液。
41.在一实施例中，所述马铃薯葡萄糖水溶液的制备方法如下：按配方量将马铃薯、葡萄糖、水混合，加热煮沸，制得所述马铃薯葡萄糖水溶液。
42.在一实施例中，所述马铃薯葡萄糖水溶液的制备方法如下：将马铃薯与水混合后，加热煮沸，然后加入葡萄糖，制得所述马铃薯葡萄糖水溶液。
43.在一实施例中，煮沸后，保持10min～20min。
44.在一实施例中，所述马铃薯葡萄糖水溶液的制备方法如下：按配方量将马铃薯、葡萄糖、水混合，加热煮沸，然后用纱布过滤，向过滤后的滤液中加水，补足至初始体积，然后加入葡萄糖，加热溶化，混匀，灭菌，得到所述马铃薯葡萄糖水溶液；
45.在一实施例中，所述灭菌是在121℃下高压蒸汽灭菌15～30min。
46.在一实施例中，每1000ml水中加有300g马铃薯、20g葡萄糖。
47.在一实施例中，所述增菌液的制备方法包括如下步骤：
48.1)称取300g去皮马铃薯，切碎块，加1000ml蒸馏水，煮沸10min～20min，用纱布过滤，补加蒸馏水至1000ml，加入20g葡萄糖，加热溶化；
49.2)向步骤1)中的混合液中加naoh水溶液和/或hcl溶液调节ph值，调节ph至6.8～7.2，121℃高压灭菌20min，灭菌后冷却至50℃；
50.3)补充添加剂，在无菌条件下将过滤除菌(过滤除菌所使用的无菌滤膜的孔径不大于0.45μm)后的龙胆紫、氯霉素、多黏菌素b、脱氢乙酸钠溶液加入步骤2)中冷却后的混合溶液中，向每1l步骤2)中制得的混合液中添加10mg龙胆紫、20mg氯霉素、10mg多黏菌素b、0.3g脱氢乙酸钠，充分混匀后分装，制得增菌液。
51.根据第三方面，在一实施例中，提供第一方面所述增菌液在检测(椰毒假单胞菌酵米面亚种)中的用途。本发明的增菌液可用于检测食品中的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)，有效抑制非目标菌的繁殖，提高目标菌的检出效率，有效减少漏检。
52.根据第四方面，在一实施例中，提供第一方面所述增菌液在筛选唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)中的用途。本发明的增菌液可用于从样品中筛选唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)，对该微生物进行进一步的研究。
53.根据第五方面，在一实施例中，提供第一方面所述增菌液在培养唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)中的用途。本发明的增菌液可用于扩大培养唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，
54.在一实施例中，本发明提供的增菌液中去皮马铃薯和葡萄糖是为微生物生长繁殖提供必要的碳源、氮源、无机盐和生长因子等营养要素。龙胆紫、氯霉素和多黏菌素b作为抑制剂，可抑制非目标细菌的生长繁殖，脱氢乙酸钠可抑制真菌如酵母菌、霉菌的生长繁殖。
55.在一实施例中，本发明与现有检测标准中gvc增菌液相比具有的优点包括：该增菌液能够较好地抑制样品中杂菌生长，可以有效抑制日常检测中出现的非目标微生物如霉菌、分散泛菌、荧光假单胞菌、霍氏肠杆菌等的生长，有利于提高检出率和工作效率，具有较强的实用性。
56.实施例1
57.本实施例提供增菌液特异性验证实验。
58.1、培养基的配制
59.增菌液：称取300g去皮马铃薯，切碎块，加1000ml蒸馏水，煮沸10min～20min，纱布过滤，补加蒸馏水至1000ml，加入20g葡萄糖，加热溶化；调节ph至6.8～7.2，121℃高压灭菌20min，灭菌后冷却至50℃；在无菌条件下将过滤除菌(所使用的无菌滤膜的孔径不大于0.45μm，本实施例为0.22μm)后的含10mg龙胆紫、20mg氯霉素、10mg多黏菌素b、0.3g脱氢乙酸钠的水溶液加入混合溶液，充分混匀后分装成10ml备用。制得的增菌液中，龙胆紫、氯霉素、多黏菌素b、脱氢乙酸钠的终浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、0.03wt％。
60.胰蛋白胨大豆肉汤(tsb)培养液：按照厂家说明书配制(北京陆桥，批号：200602)；
61.胰酪大豆胨琼脂培养基(tsa)培养基：按照厂家说明书配制(北京陆桥，批号：190815)。
62.2、菌株活化
63.接种霍氏肠杆菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、分散泛菌、食油假单胞菌、黑曲霉、非脱羧勒克菌、解甘露醇罗尔斯顿菌8株日常检测过程中分离的非目标菌以及唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(cicc10574)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(83756)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(95947)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(79123)于tsb肉汤培养基中进行活化，36℃培养24h。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(83756)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(95947)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(79123)是由发明人所在实验室自行分离得到。cicc是指中国工业微生物菌种保藏管理中心(china center of industrial culture collection)。
64.3、接种
65.将上述活化的12株菌株用无菌生理盐水进行10倍稀释，分别吸取0.1ml所得的菌液(浓度在1000cfu～5000cfu区间)转接于增菌液中，36℃培养24h。用直径3mm的接种环取增菌后的增菌液一环，划线接种于tsa平板中，36℃培养48h，观察菌株生长情况。
66.4、结果及分析
67.唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在tsa平板上生长良好，霍氏肠杆菌(革兰氏阴性菌，属名:enterobacter，种名加词:hormaechei)、荧光假单胞菌(革兰氏阴性菌，属名:pseudomonas，种名加词:fluorescens)、恶臭假单胞菌(革兰氏阴性菌，属名:pseudomonas，种名加词:putida)、分散泛菌(属名:pantoea，种名加词:dispersa)、食油假单胞菌(革兰氏阴性菌，属
名:pseudomonas，种名加词:oleovorans)、黑曲霉(真菌，属名:aspergillus，种名加词:niger)、非脱羧勒克菌(革兰氏阴性菌，属名:leclercia，种名加词:adcarboxglata)、解甘露醇罗尔斯顿菌(革兰氏阴性菌，属名:pseudomonas，种名加词:oleovorans)在tsa平板上都未见菌株生长，结果见表1，说明增菌液对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌具有较高的特异性。
68.表1菌株在培养基生长情况
[0069][0070][0071]
备注：+：表示生长；﹣：表示不生长。
[0072]
实施例2
[0073]
本实施例提供增菌液选择性评价实验
[0074]
1、培养基的配制
[0075]
按照实施例1中增菌液、培养基的组成及配制方法制备增菌液和胰酪大豆胨琼脂培养基(tsa)。
[0076]
2、接种
[0077]
非目标菌的种类以及菌悬液的制备见实施例1，最后各取1ml相关菌液制成1～5
×
103cfu/ml的混合菌液备用，在步骤1中分装的每支试管接种总量为1ml混合菌液，接种量在1000cfu～5000cfu，36℃培养24h。吸取10μl经培养后的非目标菌培养液，均匀涂布接种到非选择性tsa平板上，36℃培养48h。
[0078]
3、结果及分析
[0079]
培养48h后非目标菌在tsa平板上的菌落数为0cfu(结果见图1所示的非目标混合菌在tsa平板上的生长情况图)，未见混合菌生长，表明本发明实施例1的增菌液培养基的选择性效果良好，满足检测要求。
[0080]
实施例3
[0081]
本实施例提供食品污染模拟实验中本发明实施例1的增菌液与国家标准《gb 4789.29-2020食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检验》(下文简称国家标准gb 4789.29-2020)中的gvc增菌液的比较实验。
[0082]
从市场上购买河粉(经检测确认不含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌)，采用本发明实施例1的增菌液和国家标准gvc增菌液进行样品增菌处理，后续采用国家标准中的选择性培养基mpda(改良马铃薯葡萄糖琼脂，参见国家标准gb 4789.29-2020的附录a.2)和pcfa(参见国家标准的附录a.3)进行分离，比较两种增菌液在检测过程中的选择性增菌效果。
[0083]
1、菌液准备
[0084]
取标准菌株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(cicc10574)新鲜培养物，制备1od菌悬液，梯度稀释至10-7
稀释度(菌液浓度为1～10cfu/ml)。
[0085]
2、培养基的配制
[0086]
按照实施例1中培养基的配制步骤制备增菌液，gvc增菌液和选择性培养基mpda、pcfa按照国家标准gb 4789.29-2020附录a中的方法制备。
[0087]
3、人工污染增菌后接种
[0088]
取两份河粉，每份25g，其中一份河粉中加入225ml gvc增菌液，另一份河粉中加入本发明实施例1的增菌液，各取10-7
稀释度的标准菌悬液1ml制成模拟样本，混匀，于36℃培养24h。用接种环直接划线增菌后的增菌液于mpda和pcfa选择性分离培养基，36℃培养48h，观察各种培养基上菌落生长情况。
[0089]
4、微生物鉴定
[0090]
在选择性培养基mpda和pcfa中分别挑取5个典型或可疑菌落，使用实验室的vitek ms全自动快速微生物质谱检测系统(法国梅里埃)进行菌株鉴定。
[0091]
5、结果及分析
[0092]
样品经过本发明实施例1的增菌液增菌后，在选择性分离培养基mpda和pcfa上菌落单一且典型，见图2(1)和图3(1)，各挑取的5株可疑菌经鉴定都为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(未进行毒性试验)，鉴定率为100％。样品经过gvc增菌后在选择性分离培养基mpda中出现粘稠菌液覆盖整个平板，见图2(2)，不利于观察可疑菌株以及挑取，未鉴定出目标菌株；在pcfa上出现可疑菌落以及非目标菌落，见图3(2)，挑取的5株可疑菌经鉴定3株为目标菌，两株为非目标菌，鉴定率为60％，说明本发明实施例1的增菌液比国家标准gb 4789.29-2020中的gvc增菌液具有更好的选择性，有利于后续的分离鉴定步骤，提高检出率和工作效率，具有较强的实用性。
[0093]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。