一种DNA甲基化标志物及其应用

一种dna甲基化标志物及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种dna甲基化标志物及其应用。


背景技术：

2.高血压既是一种心血管疾病，也是其它多种心脑血管疾病的重要危险因素。全球有67％的心脏病，54％的脑卒中由高血压引起，13.5％的死亡归因于高血压。其中，脑卒中作为一个全球性的健康问题，现已成为威胁我国居民生命健康的首要疾病，每年给我国居民带来了巨大的疾病负担和经济损失。2015年中国卒中协会首次发布的《中国卒中流行报告》结果显示，我国每年脑血管病新发患者约270万，每年死于脑血管病的患者约130万，每12秒就有一人发生脑卒中，每21秒就有人死于脑卒中。因此，如何有效地预防和控制脑卒中是目前我国面临的重大公共卫生挑战，寻找并发现更多脑卒中的潜在危险因素和干预靶点迫在眉睫。
3.利钠肽轴是机体应对外界环境刺激的重要的心脏内分泌调节系统，在维持机体水钠平衡、血压稳定和能量代谢平衡方面发挥着重要作用。利钠肽轴主要由心房钠尿肽(anp)、脑钠尿肽(bnp)、c型钠尿肽(cnp)以及他们的受体构成。当血容量增加时，心肌细胞就会分泌并释放大量的无生物活性的心房钠尿肽前体(pro
‑
anp)和脑钠尿肽前体(pro
‑
bnp)，pro
‑
anp、pro
‑
nnp进一步活化为有活性的anp和bnp，并与其受体结合激活利钠肽轴，进而促进水钠代谢、降低血容量、扩张血管、促进能量代谢，从而维持心血管稳态。
4.目前，尚未见关于anp的编码基因nppa的dna甲基化与高血压和脑卒中的研究报道，也没有报道一种合适的甲基化标志物可作为预防和控制高血压和脑卒中的干预靶点。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明通过对dna甲基化与高血压和脑卒中表型相关性的研究，提供一种与高血压和脑卒中相关的dna甲基化标志物，其在预测脑卒中发病风险、脑卒中高危人群的筛查提供依据，也有望作为预防和控制高血压和脑卒中的干预靶点。
6.本发明的第一个目的是提供一种dna甲基化标志物，为nppa基因启动子区的甲基化位点chr1:11908353，并且甲基化程度与高血压或脑卒中的发病风险程度相关。
7.上述高血压、脑卒中相关的nppa基因dna甲基化标志物的检测方法，包括以下步骤：
8.(1)提取dna样本，并对dna样本进行重亚硫酸盐处理；
9.(2)用合适的引物对扩增步骤(1)经重亚硫酸盐处理后的样品，得到扩增产物；
10.(3)对步骤(2)的扩增产物进行转录和酶切，得到转录和酶切产物；
11.(4)对步骤(3)的转录和酶切产物进行检测，获取样品序列中的甲基化程度。
12.上述dna甲基化标志物在制备用于预测或检测高血压或脑卒中发病风险试剂中的应用。
13.上述dna甲基化标志物在制备用于脑卒中高危人群筛查试剂中的应用。
14.上述dna甲基化标志物在制备高血压或脑卒中治疗药物中的应用。
15.进一步地，dna甲基化是可修复的，治疗药物是基于上述nppa基因dna甲基化位点或nppa基因设计的靶向药物，可以调控nppa基因的表达和anp的分泌，进而达到降低血压、治疗脑卒中的目的。
16.本发明的第二个目的是提供一种预测脑卒中发病风险的试剂盒，包含检测上述dna甲基化标志物的甲基化程度的试剂。
17.进一步地，试剂盒包含扩增dna甲基化位点chr1:11908353的引物对。
18.进一步地，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体为：
19.f：ttttgttttgaggttagaggtttgttta
20.r：aaaaatccttaattatctcaccrcc
21.上述引物对在制备用于预测或检测高血压或脑卒中发病风险试剂中的应用。
22.上述引物对在制备用于脑卒中高危人群筛查试剂中的应用。
23.本发明的第三个目的是提供一种检测脑卒中发病风险的方法，根据上述nppa基因dna甲基化标记物的甲基化程度设置检测阈值，受试者的甲基化位点chr1:11908353的甲基化程度高于检测阈值时，受试者正常，甲基化程度低于检测阈值时，受试者存在脑卒中发病风险。
24.进一步地，nppa来源于血液，取样方便。
25.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
26.(1)本发明提供的nppa基因dna甲基化标志物可用于预测高血压和脑卒中发病风险，为脑卒中高危人群的筛查提供依据，也可以作为预防和控制高血压和脑卒中的干预靶点。
27.(2)本发明不仅有助于阐释nppa缺乏作用于高血压和脑卒中的分子机制，也将为nppa基因甲基化作为预防和控制高血压和脑卒中的药物靶点提供重要的流行病学证据。
28.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
29.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
30.图1为本发明的dna甲基化标志物的示意图；
31.图2为实施例中nppa基因启动子区域9个cpg位点的示意图，其中1号位点为本发明的甲基化标志物。
具体实施方式
32.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
33.实施例
34.在两个相互独立的人群中，分别进行发现研究(纳入了2498人，包括高血压患者
1109人和血压正常者1389人)和验证研究(纳入了1771人，包括高血压患者995人和血压正常者776人)。提取每一位研究对象的全血dna标本，运用目标区域测序技术检测nppa基因启动子区域各cpg位点甲基化水平，即利用ensembl数据库查询人类nppa基因(基因编号：ensg00000175206)的启动子区域，该区域为chromosome 1:11908117
‑
11908380(grch37.p13，距tss:
‑
540bp to
‑
277bp)，在ncbi上截取该区域的核酸序列，将核酸序列导入emboss cpgplot软件预测cpg岛，然后运用epidesigner程序对cpg岛及cpg密集区域序列进行引物设计，挑选合适的引物进行dna甲基化检测(引物序列信息见表1)。经过挑选，共获得9个cpg位点的甲基化水平，9个cpg位点如图2所示。
35.表1 nppa基因启动子区域dna甲基化检测引物序列
[0036][0037]
dna甲基化的具体检测方法为：
[0038]
首先用ez
‑
96dna甲基化试剂盒(zymo research，orange，ca)对dna标本进行重亚硫酸盐处理，将样本dna中没有甲基化修饰的胞嘧啶c全部转化为尿嘧啶u。接着用表1中的引物，以重亚硫酸盐处理后的样品基因组为模板，进行多重pcr扩增。为区分不同样品，利用带有index序列的引物，通过pcr扩增向文库末端引入和illumina平台兼容的特异性标签序列。最终，将所有样品index pcr扩增产物等量混合，在illumina hiseq/miseq平台，以2
×
150bp/2
×
250bp的双端测序模式进行高通量测序，获得fastq数据。各cpg位点甲基化水平量化为该位点甲基化的reads数目(即检测到碱基c的reads数目)/该位点总的reads数目
×
100％。
[0039]
研究结果如下：
[0040]
1、研究对象临床特征
[0041]
在两个人群中，相较于血压正常者，高血压患者具有更多的传统危险因素，例如吸烟、饮酒、肥胖、高血糖、高血脂(所有p<0.05)。
[0042]
表1研究对象的临床特征
[0043][0044][0045]
2、与高血压关系最强的甲基化位点
[0046]
如表2所示，检测的9个cpg位点的dna甲基化水平在高血压患者中均高于血压正常者。进一步调整传统危险因素之后，发现研究中仅有cpg1与血压和高血压患病显著相关，多重检验矫正后的p值均<0.05(表3)，该位点甲基化水平每升高5％，高血压患病风险下降13％。同样的，在验证研究中也发现相同的研究结果，矫正多重检验后，仅有cpg1与血压和高血压患病显著相关(所有矫正后p值<0.05)，该位点甲基化水平每升高5％，高血压患病风险下降18％(表4)。
[0047]
表2 nppa基因dna甲基化水平
[0048][0049]
表3发现研究中nppa基因dna甲基化与血压和高血压患病的关系
[0050][0051]
表4验证研究中nppa基因dna甲基化与血压和高血压患病的关系
[0052][0053]
3、能独立预测未来脑卒中发病风险的甲基化位点
[0054]
进一步对上述发现研究中的2498人进行了10年的随访，获取脑卒中发生事件，通过分析基线时nppa基因dna甲基化水平与脑卒中事件的关系，发现能够独立预测未来脑卒中发病风险的甲基化位点。结果如表5所示，矫正多重检验后，仅有cpg1与脑卒中发病风险显著相关(所有矫正后p值<0.05)，调整传统危险因素后，该位点甲基化水平每升高5％，脑卒中发病风险下降21％。
[0055]
表5基线nppa基因dna甲基化与脑卒中发病风险的关系
[0056][0057]
4、构建甲基化检测试剂盒
[0058]
基于以上研究，可以得知：如图1所示，位于启动子区域的cpg1位点发生甲基化之
后，可能抑制nppa基因表达和pro
‑
anp蛋白分泌，进而参与高血压和脑卒中的发病，可以作为脑卒中发病风险的预测标志物和潜在药物靶点。因此，本发明构建了基于cpg1位点的甲基化检测试剂盒。
[0059]
具体检测方法为：
[0060]
①
全血dna提取并质检
[0061]
a.琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna完整性：电泳条带清晰可见，无明显降解，且无rna污染。
[0062]
b.nanodrop 2000检测基因组dna质量：浓度≥20ng/μl，总量≥1μg，od260/280＝1.7～2.0，od260/230≥1.8。
[0063]
②
亚硫酸盐处理
[0064]
用ez
‑
96dna甲基化试剂盒(zymo research,orange,ca)对质检合格的dna标本进行亚硫酸盐处理，将样本dna中没有甲基化的胞嘧啶c全部转化为尿嘧啶u。
[0065]
③
多重pcr扩增
[0066]
接着用设计好的引物(f：ttttgttttgaggttagaggtttgttta；r：aaaaatccttaattatctcaccrcc)对亚硫酸盐处理过的标本进行dna扩增，得到带有t7 rna聚合酶启动子序列的扩增产物。
[0067]
④
cpg片段切割
[0068]
然后运用t7 rna聚合酶将扩增的dna产物转录为rna片段，用rnase a将所得的rna片段切割成带有cpg的小片段。
[0069]
⑤
飞行质谱分析
[0070]
最终，在每一个小的rna片段内，未甲基化的cpg最终产物为cpa，甲基化的cpg最终产物为cpg，使用agena massarray飞行质谱分析系统检测这个最终产物的分子量。
[0071]
⑥
甲基化水平计算和脑卒中风险预测
[0072]
该cpg位点甲基化水平量化为产物质量cpg/(cpg+cpa)
×
100％，甲基化水平<50％提示脑卒中发病风险较高，应密切关注并采取预防性治疗措施。
[0073]
基于以上研究可以得知：如图1所示，位于启动子区域的chr1:11908353cpg位点发生甲基化之后，可能抑制nppa基因表达和pro
‑
anp蛋白分泌，进而参与高血压和脑卒中的发病，可以作为高血压和脑卒中发病风险的预测标志物和潜在药物靶点。
[0074]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。