一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白GSW8及其编码基因和应用

一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白gsw8及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白gsw8及其编码基因和应用。


背景技术：

2.水稻是世界上最重要的粮食作物之一，为一半以上的人口提供食物和营养来源，也是我国最重要的粮食作物。据统计，到2030年我国人口将达到16亿，粮食需求总量将从2010年的5.8亿吨增至7.4亿吨。在人口不断增长，可耕土地面积日益减少、环境恶化等问题影响下，粮食生产仍然面临着巨大的压力，因此粮食安全问题越来越受到人们的关注。加之这两年全球新冠疫情的发生，进一步提高水稻产量，对确保我国粮食安全和农业可持续发展具有十分重要的战略意义。水稻产量构成因素主要包括单株有效穗数、每穗实粒数和千粒重，其中千粒重主要由粒型(包括粒长、粒宽和粒厚)决定，研究水稻粒型相关基因的分子机制、发掘优异等位基因，对提高水稻产量具有十分重要的意义。
3.迄今，有水稻粒型和千粒重相关基因被克隆，但水稻粒型和千粒重是复杂的数量性状，其分子调控网络仍然还很不清楚，很多基因也没有被应用于水稻育种。因此，迫切需要进一步挖掘更多新基因，为解析粒型调控网络提供新的思路，为育种利用提供新的基因资源。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白gsw8及其编码基因和应用，为解析粒型调控网络提供新的思路，为育种利用提供新的基因资源。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白gsw8，蛋白gsw8的氨基酸序列如seq id no.2所示，或seq id no.2所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有相同功能的氨基酸序列。
6.一种编码权利要求1所述的蛋白gsw8的基因，该基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，或seq id no.1所示的序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。
7.一种表达载体，含有上述基因。
8.一种调控水稻粒型和千粒重的制剂，该制剂包括上述蛋白质gsw8，或包括能促进上述基因过表达的有效成分。
9.上述蛋白质gsw8或基因可用于调控水稻粒型和千粒重。
10.本发明具有以下有益效果：
11.本发明提供了一种新的水稻粒型和千粒重的调控基因，该基因命名为gsw8，其编码的蛋白为gsw8。本发明利用crispr/cas9系统编辑gsw8，获得的gsw8
‑
ko突变体，表现为粒宽和千粒重显著降低，明确了该基因在调控水稻粒型和千粒重方面的生物学功能，能应用
thermocycler系统进行定量pcr反应，每个样品三次生物学重复，actin引物作为内参，序列具体如下：
28.actin
‑
f：5
’‑
gactctggtgatggtgtcagc
‑3’
(seq id no.5)；
29.actin
‑
r：5
’‑
ggctggaagaggacctcagg
‑3’
(seq id no.6)。
30.具体pcr体系如下：
31.表1定量pcr体系(10μl)
[0032][0033]
定量pcr反应程序为：95℃预变性3min，然后进行以下循环：95℃变性5s，58℃退火30s，共进行39个循环，最后65℃
‑
95℃(0.5℃/cycles)5s制备溶解曲线。
[0034]
结果分析发现，gsw8在检测的不同组织中均有表达，属于组成性表达，但在幼穗、颖壳和颖果中高表达(见图1)，这与其调控粒型和千粒重的生物学功能是相符的。
[0035]
实施例2：gsw8基因的crispr/cas9敲除载体构建和遗传转化
[0036]
1、crispr/cas9敲除靶位点选择
[0037]
为了获得功能完全丧失的突变体，我们在gsw8的第1外显子靠近atg的位置设计了一个敲除靶位点，靶位点序列为：5
’‑
ccaactaagcaatggccttt
‑3’
(seq id no.7)(图2)。
[0038]
2、crispr/cas9敲除载体构建
[0039]
本发明利用百格生物技术有限公司的crispr/cas载体构建试剂盒，选择水稻适用的crispr/cas载体bgk03，构建gsw8的敲除载体gsw8
‑
bgk03，具体过程如下：
[0040]
(1)合成oligo序列，制备oligo二聚体
[0041]
根据上述靶点序列设计与试剂盒对应的oligo
‑
f和oligo
‑
r序列，序列分别如下：oligo
‑
f：5
’‑
tgtgtgccaactaagcaatggccttt
‑3’
(seq id no.8)；
[0042]
oligo
‑
r：5
’‑
aaacaaaggccattgcttagttggca
‑3’
(seq id no.9)。
[0043]
在成都擎科公司合成上述oligo引物，将合成的oligo引物加水溶解至10μm，配制反应体系(18μl buffer anneal，1μl oligo
‑
f，1μl oligo
‑
r)，混合后，在pcr仪上95℃加热3min，然后以0.2℃/s缓慢降至20℃，即得到oligo二聚体。
[0044]
(2)将oligo二聚体连接至bgk03载体上
[0045]
在冰上配制连接反应体系(10μl)，配方如下：1μl enzyme mix、2μl bgk03 vector、1μl oligo二聚体、6μl ddh2o。混匀后，室温反应1小时，即完成连接。
[0046]
(3)大肠杆菌转化
[0047]
将dh5α感受态(唯地生物)从
‑
80℃冰箱取出，置于冰上融化，之后加入上述步骤(2)的连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min；之后42℃水浴热激50s，立即放回冰上静置2min；向离心管中加入900μl无抗lb液体培育基(配方见表2)，混匀后置于37℃摇床，180rpm
孵育60min；3000rpm室温离心3min收集菌液，留取80μl上清(其余丢弃)轻轻吹打重悬菌体，均匀涂布于含卡那霉素抗性的lb平板，置于37℃培养箱培养过夜。
[0048]
表1lb培养基配方
[0049][0050]
(4)获得gsw8敲除载体gsw8
‑
bgk03质粒
[0051]
挑取步骤(3)中lb平板上生长的单克隆，接种于5ml含卡那霉素的lb液体培养基，37℃摇床，200rpm培养过夜；用omega质粒小量提取试剂盒i(d6943)，按照说明书操作步骤提取质粒；将提取的质粒用bgk03载体构建专用测序引物(5
’‑
cccagtcacgacgttgtaa
‑3’
，seq id no.10)测序验证靶位点序列，获得连接正确的gsw8敲除载体gsw8
‑
bgk03(见图3)。
[0052]
3、水稻遗传转化
[0053]
(1)敲除载体质粒转化农杆菌eha105
[0054]
将1μl敲除载体的质粒加入1管eha105感受态细胞中，冰上静置30min；液氮中迅速冷冻2min；37℃金属浴放置5min，溶化细胞；立即加入600μl无抗lb培养基，置于28℃摇床，180rpm培养2
‑
3h；5000rpm，离心3min，留取100μl lb培养基重悬菌体；均匀涂布在含利福平和卡那霉素抗性的lb平板，28℃培养箱培养2
‑
3天。挑取平板上生长的单克隆摇菌，鉴定阳性克隆，将阳性克隆菌液保存于
‑
80℃冰箱备用。
[0055]
(2)转化水稻品种中花11
[0056]
利用农杆菌介导法(参考hiei et al.1994)，转化野生型水稻品种中花11，用潮霉素进行抗性筛选，获得阳性转基因植株。
[0057]
实施例3：gsw8基因的敲除植株鉴定和表型分析
[0058]
1、敲除植株鉴定
[0059]
获得实施例二中阳性转基因植株之后，分单株取叶片提取dna，设计跨敲除靶位点的扩增测序引物y2118
‑
f(5
’‑
ttcgtagtgcgattgtttc
‑3’
，seq id no.11)和y2119
‑
r(5
’‑
accgaccaagagcattaga
‑3’
，seq id no.12)，扩增后测序确认突变情况。如图2所示，一共获得3种不同突变方式的独立敲除株系，命名为ko1
‑
ko3。其中ko1和ko2分别缺失和插入1个碱基a，ko3缺失4bp(ctaa)，均导致移码突变，蛋白翻译提前终止(图4)，因此，所获得的gsw8敲除突变体是功能完全丧失型突变体。
[0060]
2、敲除植株表型分析
[0061]
获得上述gsw8敲除突变体之后，分别与野生型中花11回交1次，检测获得无载体残
留的纯合t3代株系进行表型分析。结果如图5所示，gsw8敲除突变体的粒长与野生型无明显差异，但粒宽显著减小，平均减小10.25％，导致千粒重平均降低17.45％，说明gsw8正调控水稻粒宽和千粒重。
[0062]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。