与花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量关联的分子标记AHGS2050及其应用

与花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量关联的分子标记ahgs2050及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量关联的分子标记及其应用。


背景技术：

2.花生(arachis hypogea l.)是重要的油料作物和经济作物，是植物油脂的重要来源。花生籽仁油脂主要由8种脂肪酸组成，分别为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、花生烯酸、山嵛酸、木蜡酸，其中棕榈酸、油酸和亚油酸为最主要的3种脂肪酸，总含量在85％以上。棕榈酸是花生油中含量最高的一种饱和脂肪酸，研究报道摄入过多的棕榈酸会增加心房纤维性颤动的风险，同时饱和脂肪酸较高的花生油低温下易凝固。油酸是一种单不饱和脂肪酸，可降低血浆中的低密度脂蛋白和胆固醇含量，起到预防心血管疾病的作用。且相较于多不饱和脂肪酸的亚油酸，油酸受热更稳定，不易氧化酸败，有利于延长花生油的货架期。因此，提高花生油酸含量，降低棕榈酸和亚油酸含量是花生品质育种的重要方向。
3.花生脂肪酸含量为数量性状，易受环境影响。基因fad2a和fad2b能同时控制油酸、亚油酸和棕榈酸含量，这两个基因同时突变可将油酸提高到75％以上，亚油酸降低到5％以下，棕榈酸降低到7％以下，目前只有这两个基因的突变位点已广泛运用到花生高油酸育种中。然而，相较于高油酸化菜籽油的脂肪酸组成(棕榈酸约为2％)，高油酸化花生油的棕榈酸含量仍然偏高。因此，需要鉴定更多的控制花生3种主要脂肪酸的稳定优异等位位点，同时开发相关标记，指导分子标记辅助选择育种，进一步改良花生油的脂肪酸组成。
4.关联分析以自然群体为研究对象，以长期重组后保留下来的基因或位点间的连锁不平衡为基础，将目标性状表型的多样性与基因或标记位点的多态性结合起来分析，可直接鉴定出与表型变异密切相关且具有特定功能的基因位点或标记位点。通过与关联位点紧密连锁的分子标记对目标表型性状进行选择，可以提高目标性状的育种效率。
5.目前能检测到同时控制花生3种主要脂肪酸(棕榈酸、油酸、亚油酸)的稳定位点数目少，在花生分子标记辅助育种中应用有限。因此，有必要进行进一步开发研究。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一个稳定的与棕榈酸、油酸、亚油酸关联的位点及其连锁的标记，用于花生油脂改良的分子标记辅助选择。
7.具体地，本发明提供如下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种与花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量关联的分子标记，所述分子标记为ahgs2050；分子标记ahgs2050能够通过如seq id no.1
‑
2所示的引物对扩增得到。
9.第二方面，本发明提供用于扩增上述分子标记的引物。
10.本发明的引物包括如seq id no.1
‑
2所示的序列。
11.第三方面，本发明提供含有上述引物的试剂或试剂盒。
12.第四方面，本发明提供上述分子标记或引物或试剂或试剂盒的以下任一应用：
13.(1)在鉴定花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量性状表型中的应用；
14.(2)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
15.(3)在花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量性状早期预测中的应用；
16.(4)在筛选或创制花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量性状不同的花生中的应用；
17.(5)在花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量基因分型中的应用。
18.第五方面，本发明提供鉴定花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量性状表型的方法，其包括：
19.(1)提取待鉴定花生的dna；
20.(2)以dna为模板，利用seq id no.1
‑
2所示引物进行pcr扩增；
21.(3)根据pcr扩增产物中dna片段的大小判断待鉴定花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量性状表型。
22.其中，步骤(3)中判断待鉴定花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量性状表型的方法如下：
23.当利用seq id no.1
‑
2所示引物进行pcr扩增后，产物中dna片段的大小为226bp时，判断待鉴定花生具有低棕榈酸含量，低亚油酸含量和高油酸含量。
24.本发明的有益效果在于：
25.本发明获得的与花生棕榈酸、油酸、亚油酸关联的分子标记ahgs2050能够在花生育种中辅助选择低棕榈酸、高油酸、低亚油酸的材料，有利于提高选育效率。
附图说明
26.图1为不同基因型材料在三个环境下的脂肪酸组成表型数据比较结果，图中，纵坐标代表对应脂肪酸含量％，**代表在0.01水平上的极显著差异(t检验)。
具体实施方式
27.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
28.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.实施例1
30.本实施例用于关联分析的292份中国花生种质资源材料由来自我国17个省份的222个品种、55个选育品系和15个地方品种组成。
31.利用ctab法从花生鲜叶中提取了292份花生资源的基因组dna，分别采用1％琼脂糖凝胶和nanodrop(thermo fisher scientific,usa)检测dna的质量和含量。用292份资源中表型变异丰富的16份材料对4485个多态性标记进行筛选，共获得583个高质量多态性标记，并用荧光染料标记进行pcr扩增。与genescan 500liz standard(applied biosystems,usa)混合的pcr产物可使用3730dna分析仪(美国应用生物系统公司)进行毛细管电泳。将电泳数据的结果可视化，并用gen emarker v2.1软件转化成位点大小(https://softgenetics.com/genemarker.php)。根据片段大小对ssr位点进行了数字编码。使用
powermarker v3.25软件计算等位位点数量、主要等位位点频率、遗传多样性和多态信息含量(pic)。群体结构(q)和亲缘关系矩阵(k)分别由structurev2.1软件和spaged软件计算获得。
32.292份资源材料分别在中国科学院油料作物研究所武汉实验基地(2015年、2016年、2017年)和四川省南充农业科学院实验基地(2017年)共四个环境下种植。田间试验采用完全随机区组设计，3次重复。每个材料种植1行12个植株，行长2m，行距0.3m，遵循标准的田间管理。依据国标法(gb/t5510
‑
2011)处理花生种子，用agilent 7890b气相色谱仪测定8种花生脂肪酸含量。
33.利用tassel软件的q+k混合线性模型(mlm模型)对四种环境下292份花生种质的脂肪酸组成表型数据和ssr标记数据进行关联作图，获得了一个新的与棕榈酸、油酸、亚油酸稳定关联的位点，该位点位于a03染色上(125.06mb)，对棕榈酸的表型贡献率为5.06
‑
8.10％，对油酸的表型贡献率为7.22
‑
9.61％，对亚油酸的表型贡献率为6.95
‑
9.42％(表1)。
34.表1棕榈酸、油酸、亚油酸显著关联的标记信息
[0035][0036]
与该位点连锁的ssr标记ahgs2050(正向引物序列：5
’‑
ccaatcttcccaaagcagaa
‑3’
(seq id no.1)；反向引物序列：5
’‑
tgagtcatgaggtgaggctg
‑3’
(seq id no.2)，可作为该位点的筛选标记。ahgs2050
‑
226bp为优异等位位点，ahgs2050
‑
234bp为非优异等位位点。
[0037]
对81份花生资源材料利用上述分子标记引物对ahgs2050进行pcr扩增(表2)。其中41份材料具有优异等位位点(扩增出的dna片段的大小为226bp)，40份材料具有非优异等位位点(扩增出的dna片段的大小为234bp)。分析这些材料在三个环境下的脂肪酸组成表型数据发现，具有标记ahgs2050优异等位位点(ahgs2050
‑
226bp)材料在三个环境下3种主要脂肪酸组成分别为棕榈酸9.64
±
1.26％(2016年武汉)，10.00
±
1.36％(2017年武汉)，10.31
±
1.24％(2017年南充)；油酸57.47
±
7.33％(2016年武汉)，55.54
±
6.73％(2017年武汉)，54.07
±
6.59％(2017年南充)；亚油酸分别为21.62
±
6.37％(2016年武汉)，24.27
±
5.82％(2017年武汉)，25.41
±
5.78％(2017年南充)(图1)。具有标记ahgs2050非优异等位位点(ahgs2050
‑
234bp)材料在三个环境下3种主要脂肪酸组成分别为棕榈酸11.61
±
1.24％(2016年武汉)，11.86
±
1.10％(2017年武汉)，12.19
±
1.22％(2017年南充)；油酸46.73
±
6.34％(2016年武汉)，44.28
±
5.56％(2017年武汉)，44.08
±
5.84％(2017年南充)；亚油酸30.68
±
5.35％(2016年武汉)，33.58
±
4.79％(2017年武汉)，33.45
±
4.83％(2017年南充)(图1)。
[0038]
由此可知，ahgs2050优异等位位点比ahgs2050非优异等位位点可分别降低1.86％～1.97％的棕榈酸，8.04％～9.31％的亚油酸,可增高油酸含量9.99％～11.26％。以上结果说明使用关联标记ahgs2050可以有效的选择低棕榈酸、高油酸、低亚油酸的花生材料。
[0039]
表2花生材料脂肪酸表型和基因型
[0040]
[0041]
[0042][0043]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。