一株解淀粉芽胞杆菌及其在半夏抗病促生长中的作用

1.本发明属于微生物应用领域，具体涉及一株解淀粉芽胞杆菌及其在半夏抗病促生长中的 作用。


背景技术：

2.半夏属天南星科半夏属多年生草本植物，其干燥块茎是我国传统的常见的中药材之一， 具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结的功效。在558种中药处方中，半夏位列第22位高频 率使用药材。半夏野生资源日益枯竭，人工种植半夏已成为最重要的药材来源，但人工种植 一直受连作障碍和土传病害问题的困扰。半夏土传病害已成为遏制人工半夏产业发展的重要 因素。
3.半夏块茎腐烂病是导致半夏减产的主要疾病，产量损失高达30％以上，甚至绝收，发 病率高达15％
‑
30％。而茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌是引起半夏块茎腐烂病病原之一。此外， 链格孢菌是链格孢属的半知菌亚门链格孢属真菌，可作为内生菌、腐生菌与致病菌，链格孢 菌的宿主范围非常广泛，除了侵染苹果、柑橘、茄子和番茄等果蔬之外，还会侵染谷类农作 物与其它经济作物，并可致使半夏发生褐斑病。筛选半夏抗病促生长微生物，为半夏专用抗 病促生长微生物肥料的研制奠定基础。
4.芽胞杆菌是最重要的植物病害生防资源菌之一，以其高效性和安全性而著称，能够拮抗 常见的主要植物病原菌。其中，已有的研究显示，解淀粉芽胞杆菌能够防治大白菜软腐病、 马铃薯黄萎病、西瓜枯萎病、水稻细菌性条斑病等，并且不同的解淀粉芽胞杆菌菌株分别抑 制不同的病原菌(崔文艳等，2020；王夏雯等，2019；戴秀华，2015；赵卫松等，2020)。 而且，徐瑛等人研究表明，解淀粉芽胞杆菌gb03具有促生长作用，可以有效提高藜麦根、 茎长及干、鲜质量，其中干重较对照组提高了300％，鲜重提高了50.69％。综上所述，解淀 粉芽胞杆菌对于植物的生长和防治越来越受到重视，但解淀粉芽胞杆菌对半夏病害和生长的 影响鲜有报道，有待进一步开发和研究。
5.生物防治是预防半夏中药材病害的首选方法。已有的研究发现，铜绿假单胞菌 (pseudomonas aeruginosa)py11t
‑3‑
1对半夏软腐病有一定的防治效果(董飞，2010)，拮 抗菌泛菌属菠萝泛菌p
‑
y2
‑
2和类香菌属香味类香味菌gj1
‑
8和恶臭假单胞菌l1
‑
5显著抑制 半夏组培苗的软腐病发生(李艳华，2010)。唐汉萌(2019)研究施用不同剂量的三种微生 物菌剂(胶质芽胞杆菌f1、解淀粉芽胞杆菌pc06和泾阳链霉菌5406)以及生物炭(600℃ 炭化的谷壳生物炭)对半夏生长、发病率和产量及品质的影响，结果发现，施用胶质芽胞杆 菌f1和施用链霉菌5406能显著改善半夏的生长势、提高半夏的产量与品质，但是施用解 淀粉芽胞杆菌pc06与对照组无显著差异。
6.本技术筛选发现一株对半夏生长和病害防治均有效果的解淀粉芽胞杆菌8
‑
2，在半夏的 病害防治和种植上有较好的应用前景。
7.参考文献：
8.(1)赵卫松，郭庆港，张晓云，王培培，苏振贺，胡卿，鹿秀云，马平，李社增.解淀 粉
芽胞杆菌phodg36菌剂的研制及其对马铃薯黄萎病的防病增产效果，中国生物防治学报， 2020，36(3)：381
‑
387.
9.(2)戴秀华，解淀粉芽胞杆菌lx
‑
11防治水稻细菌性条斑病的促生、控病机理研究，南 京农业大学硕士学位论文，2015.
10.(3)崔文艳，何朋杰，杨丽娟，李兴玉，王彪，吴毅歆，何鹏飞，何月秋.解 淀粉芽胞杆菌b9601
‑
y2对大白菜软腐病防治效果研究，植物保护，2020，46(2)：112
‑
116.
11.(4)王夏雯，吴绍军，孟佳丽.2种类型微生物肥料对连作西瓜枯萎病的防治效果研究 [j].江西农业学报，2019，23
‑
28.
[0012]
(5)徐瑛，郭晓农，蔡德育.解淀粉芽胞杆菌gb03对藜麦生长影响的初探[j].大麦 与谷类科学，2019，36(05)：10
‑
14.
[0013]
(6)董飞，半夏内生菌pseudomonas aeruginosa py11t
‑3‑
1生防效果及活性成分分析， 浙江理工大学硕士学位论文，2010
[0014]
(7)李艳华，半夏软腐病根际拮抗细菌的筛选及其鉴定，浙江理工大学硕士学位论文， 2010
[0015]
(8)唐汉萌，微生物菌剂和生物炭对半夏产量、品质及土壤微生态的影响，华中农业大 学硕士学位论文，2019)


技术实现要素：

[0016]
本发明的目的在于提供了一株解淀粉芽胞杆菌(bacillus amyloliquefaciens)，所述的解 淀粉芽胞杆菌的保藏编号为：cctcc no:m2021822，本发明的另一个目的在于提供了解淀 粉芽胞杆菌在制备半夏抗病剂中的应用。
[0017]
本发明还有一个目的在于提供了解淀粉芽胞杆菌在制备半夏抗病促生长剂中的应用。
[0018]
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0019]
申请人自自己的实验室菌种库中，筛选出一株对茄病镰刀菌、链格孢均具有较强抑制作 用的解淀粉芽胞杆菌，该细菌已于2021年7月5日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分 类命名：bacillus amyloliquefaciens 8
‑
2，保藏编号为：cctcc no:m2021822，地址：中国武 汉武汉大学。
[0020]
所述解淀粉芽胞杆菌单菌落特征：直径9.3mm，菌落形态圆形，菌落表面质地湿润， 边缘光滑圆润，菌落颜色白色、半透明，革兰氏染色阳性，适宜生长温度25℃～45℃。
[0021]
解淀粉芽胞杆菌在制备半夏抗病剂中的应用，包括利用本发明的解淀粉芽胞杆菌8
‑
2制 备成半夏茄病镰刀菌和/或链格孢的抑菌剂。
[0022]
解淀粉芽胞杆菌8
‑
2在制备半夏促生长剂中的应用。
[0023]
解淀粉芽胞杆菌在制备半夏抗病促生长剂中的应用，包括利用本发明的解淀粉芽胞杆菌 8
‑
2制备成半夏茄病镰刀菌和/或链格孢的抑菌剂，同时其具备有促进半夏生长的功能。
[0024]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0025]
本发明首次提供了一株，对半夏块茎腐烂病病原菌茄病镰刀菌和褐斑病病原菌链格孢菌 具有强烈抑制效果的解淀粉芽胞杆菌8
‑
2，同时，该菌具有较强的解磷和促进半夏
快速生长 发芽的功能，为半夏微生物肥料的研制提供了优质的种子菌株。
附图说明
[0026]
图1为解淀粉芽胞杆菌的菌落形态示意图。
[0027]
图2为双平板培养法抑菌效果示意图；
[0028]
其中：a：茄病镰刀菌；b：8
‑
2拮抗茄病镰刀菌；c：链格孢；d：8
‑
2拮抗链格孢。
具体实施方式
[0029]
以下的实例便于更好的理解本发明，但并不限于本发明。下述实施案例中的实验方法， 如无特殊说明，均为常规方法。本发明实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常 规生化试剂商店购买得到的。
[0030]
以下实施例中的试验，均设置三或四次重复实验，结果取平均值。
[0031]
lb液体培养基：向适量蒸馏水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g和氯化钠10g，调 节ph值至7.0
‑
7.5，然后用蒸馏水定容至1.0l，121℃灭菌15min。
[0032]
lb固体培养基：向适量蒸馏水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g和琼 脂20g，调节ph值至7.0
‑
7.5，然后用蒸馏水定容至1.0l，121℃灭菌15min。
[0033]
pda培养基：马铃薯汁1000ml，葡萄糖20.0g/l，琼脂20g/l，调节ph7.2～7.4，高压 灭菌锅121℃条件下灭菌30min。
[0034]
实施例1：半夏抗病功能菌株的筛选
[0035]
通过滤纸片法对实验室保藏的32株菌(包括14株枯草芽胞杆菌bacillus subtilis、6株 地衣芽胞杆菌bacillus licheniformis、3株解淀粉芽胞杆菌bacillus amyloliquefaciens、1株巨 大芽胞杆菌bacillus megafilus、1株贝莱斯芽胞杆菌bacillus velezensis、1株饲料类芽胞杆菌 paenibacillus pabuli、1株台中类芽胞杆菌paenibacillus taichungensis、1株蜡样芽胞杆菌 bacillus cereus、1株索诺拉沙漠芽胞杆菌bacillus sonorensis、1株芬氏纤维微菌 cellulosimicrobium funkei、1株红球菌rhodococcus hoagii、1株酿酒酵母菌saccharomycescerevisiae)进行半夏6株病原菌拮抗菌的初筛，6株病原菌为茄病镰刀菌fusarium solani、 尖孢镰刀菌fusarium oxysporum、链格孢aspergillus、辣椒疫霉phytophthora capsici、镰刀 菌fusarium、胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum (jones)hauben et，有透明圈，表明有抑菌作用，反之则无。
[0036]
拮抗菌处理液制备：将菌种接种于lb培养基中，在37℃180rpm条件下震荡培养12 小时制备种子菌。种子菌以2％比例接种于lb培养基中，在30℃180rpm条件下发酵12h 形成发酵液。发酵液的活菌浓度约为108cfu/ml。
[0037]
试验结果表明，32株菌中有8株菌对半夏部分病原菌具有抑制作用。其中，2株枯草芽 胞杆菌bs2、k4
‑
2对三种半夏病原菌(茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌、链格孢)均有抑制作用； 3株枯草芽胞杆菌8
‑
1、8
‑
3、bs1和1株解淀粉芽胞杆菌8
‑
2对两种半夏病原菌(茄病镰刀 菌、链格孢)具有抑制作用；枯草芽胞杆菌k3
‑
2对两种半夏病原菌(尖孢镰刀菌、链格孢) 具有抑制作用；地衣芽胞杆菌bl1对一种半夏病原菌(茄病镰刀菌)有抑制作用；枯草芽 胞杆菌bs5
‑
22和酿酒酵母菌sc对一种半夏病原菌(尖孢镰刀菌)有抑制作用。未能筛选 出抑制辣
椒疫霉、镰刀菌和胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种的菌株。
[0038]
进一步通过打孔法对以上初筛得到的8株拮抗菌进行复筛，透明圈越大反映抑菌作用越 强。
[0039]
取上述6株病原菌直径5mm菌饼，置于pda培养基平板中央。每个平板分别用打孔 器在距离平板中央2cm处打孔(直径8mm)，每个平板打2个孔，分别在每个孔加入20 μl拮抗菌培养液，于25℃恒温培养3
‑
5d后，测量抑菌圈大小。对照组平板的所有条件 均相同，仅将拮抗菌处理液替换为无菌水。
[0040]
结果发现，对照组pda平板上病菌生长迅速，菌丝布满整个平板，菌丝密集、菌落厚 实。实验组出现透明圈，。抑菌圈越大反映抑菌作用越强，抑菌圈大小见表1所示，解淀粉 芽胞杆菌8
‑
2对链格孢和茄病镰刀菌抑菌活性最强，抑菌圈直径分别为7cm和6cm。
[0041]
表1拮抗菌抑菌圈直径
[0042][0043]
注：
“‑”
表示结果阴性。
[0044]
note:"
‑
"means negative result.
[0045]
解淀粉芽胞杆菌8
‑
2已于2021年7月5日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命 名：bacillus amyloliquefaciens8
‑
2，保藏编号为：cctcc no:m2021822，地址：中国武汉武 汉大学。
[0046]
所述菌株8
‑
2单菌落特征(图1)：直径9.3mm，菌落形态圆形，菌落表面质地湿润， 边缘光滑圆润，菌落颜色白色、半透明，革兰氏染色阳性，适宜生长温度25℃～45℃。
[0047]
实施例2：
[0048]
解淀粉芽胞杆菌8
‑
2对半夏病原菌的拮抗作用
[0049]
双平板培养法抑菌试验
[0050]
取茄病镰刀菌、链格孢菌培养皿，在边缘打取直径5mm菌饼，置于pda平板一侧。 距离菌饼4cm处接种拮抗菌。以只接种茄病镰刀菌、链格孢的平板为对照。置于25℃恒 温培养箱中培养，7d后测量对照菌落半径，计算抑菌率。
[0051]
抑菌率＝(b
‑
a)/bx100％
[0052]
a：接种菌的处理组病原菌菌落直径，cm
[0053]
b：对照组病原菌菌落直径，cm
[0054]
通过双平板培养法对菌株的抑菌率进行计算，抑菌率越高表明菌株抑菌活性越高。如图 2和表3所示，8
‑
2对两株病原菌有明显的抑制作用，其中，对茄病镰刀菌抑菌率为58.12％； 8
‑
2对链格孢抑菌率为58.44％。
[0055]
表2 8
‑
2对茄病镰刀菌抑菌率
[0056] 茄病镰刀菌链格孢a:接种菌株处理组病原菌菌落直径(cm)3.273.2b:对照组病原菌菌落直径(cm)7.87.7抑菌率58.12％58.44％
[0057]
实施例3：
[0058]
解淀粉芽胞杆菌8
‑
2的解磷作用：
[0059]
菌株解磷活性大小可以通过菌落+解磷圈与菌落直径比值(d/d)大小来初步判断。解 无机磷能力定性检测：将菌株接种于无机磷固体培养基内，30℃下倒置培养7天后测定解 磷圈直径(d1)与菌落直径(d1)及d1/d1的比值，菌株三次重复。解无机磷能力定量检 测：从上述实验过程中筛选出来的菌株在lb液体培养基中，培养24h后(使其浓度为1x 108cfu/ml)，2％接种于无机磷液体培养基中，以不接菌的无机磷液体培养基为对照组。28℃ 180r/min的条件下培养7天，取培养好的发酵液5ml，置于10ml的离心管中，在4℃下 离心(10000r/min)15min，吸取上清液定容至50ml。采用钼蓝比色法测定有效磷的含量。
[0060]
解有机磷能力定性检测：将菌株接种于有机磷固体培养基内，30℃下倒置培养7天后 测定解磷圈直径(d2)与菌落直径(d2)及d2/d2的比值，做三次重复。解有机磷能力定 量检测：将上述菌株在lb液体培养基中培养24h后(使其浓度为1x108cfu/ml)，2％接 种于有机磷液体培养基中，以不接菌的有机磷液体培养基为对照组。28℃180r/min的条件 下培养7天，取培养好的发酵液5ml，置于10ml的离心管中，在4℃下离心(10000r/min) 15min，吸取上清液定容至50ml。采用钼蓝比色法测定可溶性磷的含量。
[0061]
试验结果表明，8
‑
2在无机磷固体平板上的d1/d1为1.38，解无机磷液体培养基可溶性 磷含量为72.38mg/l，相对于空白组(可溶性磷含量45.50mg/l)可溶性磷含量增加1.59倍。 8
‑
2在有机磷固体平板上的d2/d2为1.59(表4)，解有机磷液体培养基可溶性磷含量为 86.41mg/l，相对于空白组(可溶性磷含量58.94mg/l)可溶性磷含量增加1.47倍(如表4)。
[0062]
表3菌株8
‑
2在解磷固体培养基上的解磷圈情况
[0063]
菌株d1(cm)d1(cm)d1/d1d2(cm)d2(cm)d2/d28
‑
20.470.641.380.651.021.59
[0064]
注：d1表示无机磷固体平板上菌落的平均直径，d1表示无机磷固体平板上解磷圈的平均直 径。d2表示有机磷固体平板上菌落的平均直径，d2表示有机磷固体平板上解磷圈的平均直 径。
[0065]
表4菌株8
‑
2解磷活性
效果。
[0087]
表6 8
‑
2菌株抑制半夏病原菌试验
[0088][0089]
表7 k4
‑
2菌株抑制半夏病原菌试验
[0090][0091][0092]
实施例6:
[0093]
解淀粉芽胞杆菌8
‑
2发酵条件：
[0094]
解淀粉芽胞杆菌8
‑
2以接种量4％接种于lb培养基中，39℃、转速220r/min、装液量 20ml/100ml，培养时间为12h，最后的有效均浓度是3.6x109cfu/ml。
[0095]
lb液体培养基配方为：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl 10.0g，加盐酸或naoh 调ph值至7.0，定容至1000ml，高压灭菌锅121℃条件下灭菌20min。