一种制备慢病毒的方法及装置与流程

1.本发明涉及慢病毒制备领域，具体涉及一种制备慢病毒的方法及装置。


背景技术：

2.磷酸钙法制备慢病毒，较普遍的方式为在一个容器内，将去离子水、氯化钙、质粒混合后，向内缓慢加入hbs溶液，同时通过磁力搅拌的方式使其混合均匀，形成含磷酸钙
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dna复合物，然后将转染复合物加入细胞工厂中，通过晃动细胞工厂将内部培养基与转染复合物混匀。由于混合转染试剂形成磷酸钙
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dna复合物的过程，是开放的环境(生物安全柜内，容器敞口)，添加质粒等原料的时候，容易引入微生物，存在污染风险。转染复合物需转移进细胞工厂内与培养基混匀，此步有两种方式，一种为将转染混合液直接加入细胞工厂中，通过缓慢晃动细胞工厂，达到转染复合物与培养基混合均匀的目的，因细胞工厂结构特殊，转染复合物与培养基可能存在混合不均匀的情况，造成细胞工厂内每一层转染复合物分布不均，同时，因慢病毒制备使用的生产细胞为hek293t细胞，贴壁性不强，摇晃混合转染复合物与培养基，可能会导致细胞脱落，影响质粒的转染效率。另一种方式为将转染复合物加入到一个简单的换液装置中，然后将细胞工厂与此装置连通，将细胞工厂内培养基通过蠕动泵泵入装置内与转染复合物混合均匀后再泵回至细胞工厂内。此方式的缺点为转染试剂转移至换液装置的过程也是开放的环境(生物安全柜内)，存在一定的污染风险。
3.专利cn201822035919.0公开了一种便于批量包装慢病毒的混合器，混合器本体设有两个储液腔体，分别是a液贮液瓶和b液贮液瓶，a液贮液瓶和b液贮液瓶之间设有连通结构，所述的连通结构上设有控制装置，所述的连通结构为软管，a液贮液瓶一侧设有固定装置，b液贮液瓶底部设有振动结构，所述的b液贮液瓶内设有注射针，b液贮液瓶顶部设有进针口，注射针一端连接软管，注射针通过进针口进入b液贮液瓶，注射针另一端为出液口，出液口设置在b液贮液瓶底部，出液口倾斜设置。优点在于不但节约了包装慢病毒时a液与b液混合时操作的劳动强度与时间，而且还适用于批量慢病毒的包装；另有加工简单，可反复使用，成本低廉，便于推广等优点。但是，该混合器只能用于包装慢病毒的a液和b液的混合，并没有提供混合后导入培养容器中的过程；b液贮液瓶没有设置出液口，当a液和b液混合完成后，将混合液转入培养容器中时只能打开盖子，取出混合液，容易造成污染；该混合式设置有两个贮液瓶，人员需要对两个贮液瓶进行观察和处理，同样需要付出较多劳动力；a液贮液瓶上连接加压设备，b液贮液瓶上有排压口，容易造成液体充满b液贮液瓶将液体压出；另外，该混合器也未有收集废弃液的部件，未能形成一套封闭的混合装置，避免造成污染。
4.专利cn202021193441.5公开了一种用于慢病毒制备的细胞培养容器连通器及混合器，其能简化病毒制备的流程，将转染试剂的合成步骤与转染试剂和培养基混合的步骤简化至在同一个装置内完成的同时降低了污染风险，且能使转染试剂与培养基能更充分的混合。其直接与细胞培养容器连接，未有起到缓冲和暂停作用的中间装置，并且其中的细胞工厂连通器只是采用的单通道接头，采用单通道接头容易导致质粒混合液形成一股速度较快的流量将黏附于细胞工厂壁上的细胞脱落，严重影响细胞的转染成功率，并且该技术中
也没有使用废液罐装置，每次需要人工收集废液，并且污染物也容易从废液管中进入整个制备装置中，没有形成完全意义的封闭状态。


技术实现要素：

5.本发明为了解决上述问题，提供了一种制备慢病毒的装置，通过增设装有培养基的储液袋，使得转染复合物与培养基混合在储液袋中进行，进一步充分混合，提高了操作效率，并能起到一定的缓存作用；另外，本发明装置还设置了废液容器，形成一套封闭的混合装置，降低了环境污染的风险；并且该装置中的细胞工厂连通器采用了一分多转接头，极大的提高了细胞的转染率。
6.本发明目的之一在于提供一种制备慢病毒的装置，各部件可拆卸组装，方便慢病毒的培养制备，具体技术方案如下：
7.一种制备慢病毒的装置，包括混合容器和细胞培养容器，所述混合容器置于磁力搅拌器上，所述混合容器通过带有泵的第一管道与储液袋连接，所述储液袋通过带有止流装置的第二管道与细胞培养容器连接，所述细胞培养容器通过带有单向阀的第三管道连接废液容器。
8.具体的，所述混合容器和第一管道之间设置泵。
9.具体的，所述混合容器、储液袋，细胞培养容器和废液容器为可拆卸组装。
10.具体的，所述混合容器由试剂瓶和转接瓶盖组成，所述转接瓶盖上的第一接头、空气滤头和第二接头分别连接第一导管、第二导管和第三导管贯穿所述转接瓶盖，所述第一导管置于试剂瓶的底端设置沉头，所述试剂瓶的底部设置有磁力搅拌子。
11.具体的，所述试剂瓶为1
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20l的高硼硅玻璃试剂瓶。
12.具体的，空气滤头为0.22μm空气滤器。
13.具体的，所述储液袋包括第三接头、第四接头和第五接头，所述第三接头与第一接头通过带有泵的第一管道连接，所述第四接头通过带有止流装置的第二管道与所述细胞培养容器连接。
14.具体的，所述细胞培养容器由细胞工厂、细胞工厂连通器和蠕动泵构成，所述细胞工厂连通器将细胞工厂与蠕动泵连接，所述细胞工厂连通器通过三通转化头分别与所述储液袋和废液容器连接。
15.具体的，所述细胞工厂连通器为一分多转接头，所述蠕动泵为多通道蠕动泵。
16.具体的，所述细胞工厂连通器连接n个细胞工厂，n为整数，优选为1～8个细胞工厂。
17.具体的，所述储液袋和所述三通转化头之间的第二管道上设置有止流阀。
18.具体的，所述止流装置为止流阀。
19.具体的，所述废液容器和所述三通转化头之间的第三管道上设置有单向阀。
20.本发明中的细胞工厂连通器可以为一分2,1分4，一分多或者几个一分多连通器串联的细胞工厂连通器。
21.本发明目的之二在于提供一种制备慢病毒的方法，主要将转染复合物和培养基置于储液带中进行均匀混合，具体技术方案如下：
22.一种制备慢病毒的方法，将混合得到的转染复合物泵入装有培养基质的储液袋
中，将混合了培养基质的转染复合物泵入细胞培养器中进行慢病毒培养。
23.具体的，所述细胞培养器中产生的废液和输液袋中多余的混合了培养基质的转染复合物可排除至废液罐中。
24.具体的，所述储液袋中的培养基为2％dmem。
25.具体的，所述细胞培养器在37℃，5％co2的条件下培养40
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48h获得慢病毒。
26.本发明的有益之处在于：
27.1、将转染复合物和培养基的混合从细胞工厂转移至了储液袋，使得其混合更充分，并且能起到一定的缓存作用，使得整个操作更加安全，提高了操作效率。
28.2、本装置中设置了废液容器，减少了人工成本，并且污染物也不会从废液管中进入整个制备装置中，使的整个装置形成了完全意义的封闭状态。
29.3、本装置中的细胞工厂连通器采用一分多转接头，避免了细胞工厂中的细胞脱壁，极大的提高了细胞的转染率。
附图说明
30.图1为本发明制备慢病毒的装置。
31.图2为本发明的装置中的混合容器。
32.图中，1
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混合容器，11
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试剂瓶，12
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沉头，13
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转接瓶盖，14
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第一接头，15
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空气滤头，16
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第二接头，17
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磁力拌子，18
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第一导管，19
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第二导管，110
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第三导管，2
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储液袋，20
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第一管道，201
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泵，211
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第三接头，212
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第四接头，213
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第五接头，3
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细胞培养容器，30
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第二管道，301
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止流阀，31
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细胞工厂，32
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细胞工厂连通器，33
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蠕动泵，34
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三通转化头，4
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废液容器，40
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第三管道，401
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单向阀。
具体实施方式
33.下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的结构思路、使用范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
34.实施例1一种制备慢病毒的装置
35.图1是制备慢病毒的装置示意图，需要说明的是，该装置只是一个适配于本技术的示例，不能认为是提供了对本技术的使用范围的任何限制。该装置也不能解释为需要依赖于或者必须具有图1中示出的示例性的制备慢病毒的装置的一个或者多个组件。
36.如图1所示，本发明公开了一种制备慢病毒的装置，包括混合容器1和细胞培养容器3，混合容器1通过的第一管道20与储液袋2连接，储液袋2通过带有止流装置的第二管道30与细胞培养容器3连接，细胞培养容器3通过第三管道40连接废液容器4。
37.本装置能将转染复合物和培养基的混合从细胞工厂转移至了储液袋，使得其混合更充分，并且能起到一定的缓存作用，使得整个操作更加安全，提高了操作效率。
38.另外，本装置还设置了废液容器，减少了人工成本，并且污染物也不会从废液管中进入整个制备装置中，使的整个装置形成了完全意义的封闭状态。
39.基于上述装置，混合容器1和第一管道20之间设置有泵201，可用于泵取混合容器1
中的液体。
40.基于上述装置，为了更好的清洗或搬运该装置，混合容器1、储液袋2，细胞培养容器3和废液容器4为可拆卸组装，通过相应的管道和接头进行组装，能更好的个性化改装，更换部件。
41.基于上述装置，如图2所示，装置中的混合容器1由试剂瓶11和转接瓶盖13组成，转接瓶盖13上的第一接头14、空气滤头15和第二接头16分别连接第一导管18、第二导管19和第三导管110贯穿转接瓶盖13，第一导管18置于试剂瓶11的底端设置沉头12，试剂瓶11的底部设置有磁力搅拌子17。当该试剂瓶11放置于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌开关，磁力搅拌子17能在试剂瓶底部对旋转搅拌。
42.具体的，试剂瓶11可为1
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20l的高硼硅玻璃试剂瓶，空气滤头15为0.22μm空气滤器。
43.基于上述装置，储液袋2包括第三接头211、第四接头212和第五接头213，第三接头211与第一接头14通过带有泵201的第一管道20连接，第四接头212通过带有止流装置的第二管道30与细胞培养容器3连接。
44.基于上述装置，细胞培养容器3由细胞工厂31、细胞工厂连通器32和蠕动泵33构成，细胞工厂连通器32将细胞工厂31与蠕动泵33连接，所述细胞工厂连通器32通过三通转化头34分别与所述储液袋2和废液容器4连接。
45.在具体装置中，细胞工厂连通器32为一分多转接头，具体为一分2或1分4，或者几个一分多连通器串联，该细胞工厂连通器的改进避免了细胞工厂中的细胞脱壁，极大的提高了细胞的转染率；与之连接的蠕动泵33为多通道蠕动泵。
46.基于上述装置，细胞工厂连通器连接n个细胞工厂，n为整数，可以如图1所示连接4个，具体可连接1～8个细胞工厂31。
47.基于上述装置，止流装置为止流阀301。
48.基于上述装置，废液容器4和三通转化头34之间的第三管道40上设置有单向阀401。
49.基于上述装置，在某些特定具体装置中，第一接头14、第三接头211和第四接头212是快接头，或者是cpc接头；第五接头213为鲁尔接头。
50.实施例2一种制备慢病毒的方法
51.利用实施例1中的装置制备慢病毒的方法，将混合得到的转染复合物泵入装有培养基质的储液袋2中，将混合了培养基质的转染复合物泵入细胞培养器3中进行慢病毒培养。
52.基于上述的方法，储液袋2中的培养基为2％dmem，细胞培养器3在37℃，5％co2的条件下培养40
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48h获得慢病毒。细胞培养器3中产生的废液和输液袋中多余的混合了培养基质的转染复合物可排除至废液容器4中。
53.具体操作步骤如下：
54.(1)使用规格为2l的混合容器1与细胞工厂连通器32进行灭菌后使用，根据所需处理的细胞量调整细胞工厂连通器32中一分多转接头及转染混合容器的大小。
55.(2)慢病毒包装前2天，在细胞工厂31内按适当密度接种，在转染前对细胞工厂31进行换液，每个10层细胞工厂31加入对应的培养基1～2l。
56.(3)开始转染时，将混合容器1置于磁力搅拌器上，拧开第二接头16，将0.22μm针头滤器与第二接头16连接，根据培养容器总面积，通过针头滤器向混合容器中加入适量质粒与氯化钙溶液、注射用水。打开磁力搅拌器，搅拌均匀后，关闭磁力搅拌器，静置5～10min。
57.(4)打开磁力搅拌器，转速调至瓶内形成涡旋。通过第二接头16，匀速加入hbs溶液。hbs投料完毕后，关闭磁力搅拌器，静置孵育5～8min，充分形成转染复合物。
58.(5)将混合容器1中的第一接头14打开，通过两端装有cpc接头的硅胶泵管与装有培养基的储液袋2连接，将转染复合物泵入储液袋2中，与培养基均匀混合。
59.(6)将细胞工厂连通器32通过带有止流阀301的第二管道30与装有转染复合物的储液袋2连接，保持细胞工厂连通器32上的止流阀301处于关闭状态，细胞工厂连通器32装有单向阀401的一端与废液容器4连接。将细胞工厂31通过cpc接头与细胞工厂连通器32连接，将多路细胞工厂31连接的软管与多通道流量计量型的蠕动泵33连接，该细胞工厂连通器可以为一分2,1分4，一分多或者几个一分多连通器串联的细胞工厂连通器。
60.(7)打开多通道流量计量型的蠕动泵33，将细胞工厂31中的培养基通过单向阀401端排出，打开止流阀301，调整蠕动泵33泵液方向，将装有转染复合物的储液袋2中的培养基，全部泵入细胞工厂31后，关闭止流阀301，断开细胞工厂31与细胞工厂连通器32的连接，将细胞工厂31移入培养箱中，5％co2,37℃培养40～48h收获慢病毒上清。
61.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。