一种检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组、LAMP试剂盒及其应用

一种检测生姜腐烂病病原的lamp引物组、lamp试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及病原检测技术领域，尤其涉及一种检测生姜腐烂病病原的lamp引物组、lamp试剂盒及其应用。


背景技术：

2.生姜腐烂病是近年来发现的一种新的生姜病害，造成生姜根茎部腐烂，坏死，具有发病快、传染性强、危害大等特点，进而导致生姜减产甚至绝收，严重影响生姜产量及品质。生姜腐烂病的症状与姜瘟病的类似，但是其病原菌完全不同，生姜腐烂病的病原菌经鉴定为肠杆菌(阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌)。
3.对于该新发病害生姜腐烂病若是继续沿用与姜瘟病类似的防治方法，其治疗效果不佳，因此，在种姜筛选或病害侵染初期及时准确检测生姜腐烂病原，对于控制病害发生、规避病害流行风险以及提高生姜产量和经济效益具有重要意义。


技术实现要素：

4.鉴于此，本技术提供一种检测生姜腐烂病病原的lamp引物组、lamp试剂盒及其应用，能够简单、高效的检测出生姜腐烂病原，特异性好、灵敏度高。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.一种检测生姜腐烂病病原的lamp引物组，包括一对外引物f3和b3，一对内引物fip和bip，所述外引物的序列为：
7.f3：5'
‑
caggccgttccaactctg
‑
3'；
8.b3：5'
‑
aacgggtgtatttggtcagg
‑
3'；
9.所述内引物的序列为：
10.fip：5'
‑
gtaacaccggagtcaacggcaa
‑
gctgataagccgctggttg
‑
3'；
11.bip：5'
‑
acgtggcggtactgttcagtac
‑
ttcgccggatacatctcgc
‑
3'。
12.相对于现有技术，本发明提供的检测生姜腐烂病病原的lamp引物组具有以下优势：
13.本技术以肠杆菌特异性引物ropb序列为基础，特异性设计一对外引物f3和b3，一对内引物fip和bip，使得含有生姜腐烂病病原dna片段的待测物能够利用上述引物进行大量扩增，进而准确检测出生姜腐烂病病原(阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌)，且与姜瘟病原青枯雷尔氏菌，白菜软腐病原欧文菌、芽孢杆菌、水稻白叶枯病原黄单胞杆菌、马铃薯黑胫病原黑腐果胶杆菌、黄瓜角斑病原丁香假单胞菌、大肠杆菌、生姜花皮病原链格孢、生姜花皮病原尖孢镰刀菌和麦根腐平脐孺孢菌等均无交叉扩增反应，特异性强；且上述lamp引物组的灵敏度高，对生姜腐烂病病原的最低检测限为10fg/μl，能够在种姜筛选或病害侵染初期及时准确检测出生姜腐烂病原，同时，检测的准确度高，且无需特殊的仪器和专业的操作人员，实现了在任意场合进行快速检测生姜腐烂病病原的目的，对控制生姜腐烂
病病害发生、规避病害流行风险以及提高生姜产量和经济效益具有重要意义。
14.本发明还提供上述检测生姜腐烂病病原的lamp引物组在非诊断性检测生姜腐烂病病原肠杆菌中的应用。
15.优选的，所述肠杆菌为阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌或弗氏柠檬酸杆菌中的至少一种。
16.本发明还提供一种检测生姜腐烂病病原的lamp试剂盒，所述试剂盒包含上述检测生姜腐烂病病原的lamp引物组。
17.优选的，所述试剂盒还包括缓冲液、硫酸镁、dntp、dna聚合酶和去离子水。
18.本发明还提供利用上述试剂盒检测生姜腐烂病病原的方法，具体操作为：提取待测物的基因组dna为模板，用上述lamp试剂盒进行环介导等温扩增，扩增完成后加入荧光染料，观察结果。
19.环介导等温扩增结束后，向扩增产物中加入荧光染料后观察颜色变化，若是颜色发生变化，说明待测物中含有生姜腐烂病病原肠杆菌dna片段；若是颜色不发生变化，还呈现荧光染料本身的颜色，说明待测物中不含有生姜腐烂病病原肠杆菌dna片段，或是含有其他其他病原菌，并未发生扩增反应。
20.上述提取待测物的基因组dna的方法为本领域常规的dna提取方法。
21.上述检测生姜腐烂病病原的方法，操作简单、反应时间短、反应结果直观准确，可用于生姜腐烂病病原的快速检测。
22.优选的，所述环介导等温扩增的反应体系包括以下试剂及用量：10
×
thermopol缓冲液2.5μl，100mm硫酸镁1.5μl，10mm dntp 3.5μl，5μmf3、5μm b3、40μm fip和40μm bip各1μl，8000u/ml bstdna聚合酶1μl，dna模板1μl～2μl，去离子水补足至25μl。
23.上述dntp(脱氧核糖核苷三磷酸混合物)中每种碱基的终浓度为1.4mm。
24.上述环介导等温扩增的反应体系中dna模板中的浓度为＞10个拷贝数。
25.上述优选的反应条件可进一步提生姜腐烂病病原的检测效率。
26.优选的，所述环介导等温扩增的反应温度为60℃，反应时间为60min。
27.优选的，所述荧光染料为sybr green i核酸染料，且所述荧光染料的用量为0.5μl。
28.环介导等温扩增结束后，向扩增产物中加入0.5μl的sybr green i核酸染料后观察颜色变化，若是颜色呈荧光绿色，说明待测物中含有生姜腐烂病病原肠杆菌dna片段；若是颜色不发生变化，还呈现荧光染料本身的颜色橙色，说明待测物中不含有生姜腐烂病病原肠杆菌dna片段，或是含有其他其他病原菌，并未发生扩增反应。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1是本发明实施例1提供的检测生姜腐烂病病原方法特异性试验结果图；
31.图2是本发明实施例2提供的检测生姜腐烂病病原方法灵敏度试验结果图。
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
33.以下实施例中使用的主要试剂及仪器：bstdna聚合酶(neb公司)、缓冲液(neb公司)、硫酸镁(neb公司)、dntp(neb公司)、sybr gree n i核酸染料(酷来搏公司)，去离子水(康为试剂公司)、真菌基因组dna快速抽提试剂盒(聚合美公司)、pcr仪(bio
‑
rad公司，扩增仪型号t100 th ermalcycler)。
34.生姜腐烂病原阴沟肠杆菌、生姜腐烂病原阿氏肠杆菌、生姜腐烂病原弗氏柠檬酸杆菌，姜瘟病原青枯雷尔氏菌，白菜软腐病原欧文菌、芽孢杆菌、水稻白叶枯病原黄单胞杆菌、马铃薯黑胫病原黑腐果胶杆菌、黄瓜角斑病原丁香假单胞菌、大肠杆菌、生姜花皮病原链格孢、生姜花皮病原尖孢镰刀菌、麦根腐平脐孺孢菌均由本实验室临床检测分离鉴定后保存。
35.实施例1
36.一种检测生姜腐烂病病原的lamp引物组，包括一对外引物f3和b3，一对内引物fip和bip，所述外引物的序列为：
37.f3：5'
‑
caggccgttccaactctg
‑
3'；
38.b3：5'
‑
aacgggtgtatttggtcagg
‑
3'；
39.所述内引物的序列为：
40.fip：5'
‑
gtaacaccggagtcaacggcaa
‑
gctgataagccgctggttg
‑
3'；
41.bip：5'
‑
acgtggcggtactgttcagtac
‑
ttcgccggatacatctcgc
‑
3'。
42.检测生姜腐烂病病原的lamp试剂盒，包括上述lamp引物组、10
×
ther mopol缓冲液、硫酸镁、dntp、dna聚合酶和去离子水。
43.利用上述lamp试剂盒检测生姜腐烂病病原的方法，具体操作为：
44.步骤一、提取待测物的基因组dna，其中待测物分别为生姜腐烂病原阴沟肠杆菌、生姜腐烂病原阿氏肠杆菌、生姜腐烂病原弗氏柠檬酸杆菌，不含生姜腐烂病原的阴性对照，姜瘟病原青枯雷尔氏菌，白菜软腐病原欧文菌、芽孢杆菌、水稻白叶枯病原黄单胞杆菌、马铃薯黑胫病原黑腐果胶杆菌、黄瓜角斑病原丁香假单胞菌、大肠杆菌、生姜花皮病原链格孢、生姜花皮病原尖孢镰刀菌、麦根腐平脐孺孢菌。
45.步骤二、以上述基因组为模板，分别用上述所述的lamp试剂盒进行环介导等温扩增，等温扩增的条件为：60℃，扩增反应60min；所用扩增的反应体系包括以下试剂及用量：10
×
thermopol缓冲液2.5μl，100mm硫酸镁1.5μl，10mm dntp 3.5μl，5μm外引物f3、5μm外引物b3、40μm内引物fip和40μm内引物bip各1μl，8000u/ml bstdna聚合酶1μl，dna模板1μl，去离子水补足至25μl，其中dna模板中的浓度＞10个拷贝数。
46.步骤三、环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中加入0.5μl sybr green i核酸染料，然后观察颜色变化。结果如图1所示，含有生姜腐烂病原肠杆菌(阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌)dna片段的待测物的反应管呈荧光绿色，含有其他病原菌的待测物的反应管无变化，仍呈染料本身的橙色。
47.由上述结果可知，具有生姜上其它病原及其它植物真菌细菌检测结果均为阴性，
生姜腐烂病原肠杆菌(阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌)结果均为阳性，由此说明，本发明所提供的检测生姜腐烂病病原的lamp引物组、lamp试剂盒能明确检测生姜腐烂病原，特异性好，具有不出现假阳性结果的优势，且与姜瘟病原青枯雷尔氏菌，白菜软腐病原欧文菌、芽孢杆菌、水稻白叶枯病原黄单胞杆菌、马铃薯黑胫病原黑腐果胶杆菌、黄瓜角斑病原丁香假单胞菌、大肠杆菌、生姜花皮病原链格孢、生姜花皮病原尖孢镰刀菌和麦根腐平脐孺孢菌等均无交叉扩增反应。
48.实施例2
49.一种检测生姜腐烂病病原的lamp引物组，包括一对外引物f3和b3，一对内引物fip和bip，所述外引物的序列为：
50.f3：5'
‑
caggccgttccaactctg
‑
3'；
51.b3：5'
‑
aacgggtgtatttggtcagg
‑
3'；
52.所述内引物的序列为：
53.fip：5'
‑
gtaacaccggagtcaacggcaa
‑
gctgataagccgctggttg
‑
3'；
54.bip：5'
‑
acgtggcggtactgttcagtac
‑
ttcgccggatacatctcgc
‑
3'。
55.检测生姜腐烂病病原的lamp试剂盒，包括上述lamp引物组、10
×
ther mopol缓冲液、硫酸镁、dntp、dna聚合酶和去离子水。
56.利用上述lamp试剂盒检测生姜腐烂病病原的方法，具体操作为：
57.步骤一、分别提取生姜腐烂病病原基因组(阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌)的dna，并将dna溶液进行稀释，梯度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl和1fg/μl。
58.步骤二、以上述基因组为模板，分别用上述所述的lamp试剂盒进行环介导等温扩增，等温扩增的条件为：60℃，扩增反应60min；所用扩增的反应体系包括以下试剂及用量：10
×
thermopol缓冲液2.5μl，100mm硫酸镁1.5μl，10mm dntp 3.5μl，5μm外引物f3、5μm外引物b3、40μm内引物fip和40μm内引物bip各1μl，8000u/ml bstdna聚合酶1μl，dna模板，去离子水补足至25μl，其中dna模板中的浓度＞10个拷贝数。
59.步骤三、环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中加入0.5μl sybr green i核酸染料，然后观察颜色变化。
60.结果如图2所示，当阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌的dna浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl时，反应结果均显示阳性，含有生姜腐烂病原肠杆菌dna片段的待测物的反应管呈荧光绿色。由此可知，本发明所提供的检测生姜腐烂病病原的lamp引物组、检测生姜腐烂病病原的lamp试剂盒能明确检测生姜腐烂病原，灵敏度高，对生姜腐烂病原dna的检出最低限为10fg/μl。
61.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。