一种用茉莉花培养生产细菌纤维素的方法

1.本发明涉及细菌纤维素的制备领域，尤其涉及一种用茉莉花培养生产细菌纤维素的方法。


背景技术：

2.细菌纤维素是细菌利用葡萄糖合成的由β
‑
1，4
‑
糖苷键连接而成的纤维素。因其具有超高的纯度、高结晶性、高杨氏模量、优良的生物可降解性、高持水量和良好的生物相容性等特点，已作为新型生物可降解材料用于食品、化学工业和医学领域。目前，细菌纤维素已经成功应用于烧伤敷料、退热贴、高端面膜等产品的基材而在各国实现了规模化生产。
3.基于上述多方面的优异性能，细菌纤维素在多个领域有广阔的应用前景，成为研究热点。(1)在医用材料上，细菌纤维素用于组织工程支架、人工血管、人工角膜、人工皮肤以及治疗皮肤损伤等方面；(2)在食品工业上，细菌纤维素具有很强的亲水性、持水性、稳定性及完全不被人体消化的特点，可作为食品的增稠剂、成型剂、分散剂和结合剂等，作为一种新型食品基料，也用于饮料、功能食品的制造；(3)在造纸工业上，细菌纤维素可提高纸张的性能、开发新型纸张及特种纸；另外细菌纤维素也用于生产高级音响设备振动膜、超级滤膜、生物传感器表面膜等。
4.目前工业上生产细菌纤维素的主要原料葡萄糖、甘露醇、蔗糖等均是商品化的试剂，成本较高，制约了细菌纤维素的规模化生产和应用，因此寻找、开发廉价的生产原料、降低生产成本是开发利用细菌纤维素的关键。近年来，已有报道利用工农业原料和废弃物制备bc的各种尝试，如利用魔芋、麦秆、稻秆、甘蔗糖蜜、纸浆废料、腰果树残渣、废弃棉织物和云杉水解液等。
5.茉莉花渣是茉莉花加工过程中的主要副产物，但由于茉莉花渣所含精油低且口感粗糙，一直以来未引起人们的重视。茉莉花渣过去大多作为家畜饲料或废弃物倾倒，造成了资源浪费和环境污染。目前茉莉花渣主要的利用方式包括：制备甲烷、乙醇、食品添加剂、饲料等。茉莉花渣质中一般含有水溶性碳水化合物8.04％、游离氨基酸3.41％、维生素c0.21％、粗蛋白18.95％、粗脂肪4.45％、粗纤维10.10％、还含有许多微量元素、叶黄素等，这些发酵制备bc，不仅可以降低bc生产成本，还可以解决废弃茉莉花渣造成的环境污染等问题。
6.废弃茉莉花尚无有效的利用途径大部分作为垃圾处理造成很大的资源浪费。如果能够合理利用这些废料，既提高了经济效益保护生态环境，又可增加对生物资源的多层次利用提高生态效益，实现废物循环利用和农业的可持续发展。
7.目前，废弃茉莉花没有被有效利用，如何寻找一种利用废弃茉莉花，废物利用的的方式成为研究的重点。


技术实现要素：

8.本技术提供了一种用茉莉花培养生产细菌纤维素的方法，以解决如何实现批量化
低成本生产细菌纤维素的技术问题。
9.第一方面，本技术提供了一种用废弃茉莉花培养生产的细菌纤维素的方法，所述方法包括以下步骤：
10.获取茉莉花；
11.从所述茉莉花中提取出黄酮，后进行酶解，得到茉莉花酶解液；
12.向所述茉莉花酶解液中接种生产菌，并培养，得到细菌纤维素；其中，以质量浓度计，每毫升所述茉莉花酶解液的黄酮含量≤20mg qe/g。
13.可选的，所述从所述茉莉花中提取出黄酮包括：在超声波和醇水溶液的条件下从所述茉莉花中提取出黄酮。
14.可选的，所述酶解包括：
15.在所述茉莉花残渣中加入酸性缓冲液，后加入纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶，进行酶解反应，得到酶解液；
16.可选的，所述茉莉花的沉淀和所述酸性缓冲液的固液比为0.005g∶1ml～1g∶10ml。
17.可选的，所述酶解液中酶终浓度包括：纤维素酶活的浓度为850
‑
1000u/g、蛋白酶的浓度为46000
‑
48000u/g和木聚糖酶活的浓度为92000
‑
94000u/g。
18.可选的，所述酶解的温度为40
‑
60℃，ph为4.0
‑
5.5，时间为24
‑
48h。
19.可选的，所述生产菌包括木糖驹形氏杆菌或木醋杆菌。
20.一种上述的制备方法在制备细菌纤维素或利用废弃茉莉花中的应用。
21.本技术实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
22.本技术实施例提供的该方法，用茉莉花经过处理后作为细菌纤维素发酵产生菌的培养底物，扩大了茉莉花的应用范围，常规的茉莉花用于培养生产细菌纤维素产量低，茉莉花中的活性物质抑制生产菌种的活性，无法批量生产细菌纤维素，通过提取出黄酮，每毫升所述茉莉花酶解液的黄酮含量≤20mg qe/g，使茉莉花可以广泛被利用，批量生产出细菌纤维素，成本低，同时所述细菌纤维素具有极强的抗菌性。
附图说明
23.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为本技术实施例提供的用废弃茉莉花水解培养生产的细菌纤维素的流程示意图；
26.图2是传统方法制备的细菌纤维素膜(hs)和实施例1中用茉莉花水解液制备的细菌纤维素膜(ml)的红外光谱图；
27.图3是对比例1得到的hs和实施例1中所制得的ml的xrd图；
28.图4是对比例1得到的hs和实施例1中所制得的ml的tg图；
29.图5是实施例1和对比例1得中所制得的细菌纤维素对大肠杆菌的抑菌效果图；
30.图6是实施例1和对比例1得中所制得的细菌纤维素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
图；
31.图7是酶解液中黄酮的含量与细菌生产素的关系图；
32.图8本技术实施例提供的用废弃茉莉花水解培养生产的细菌纤维素的流程示意图。
具体实施方式
33.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
34.本技术中的化学试剂、仪器和生产菌种可以通过市售渠道获得。
35.本技术提供了一种用废弃茉莉花培养生产的细菌纤维素的方法，如图1所示，所述方法包括以下步骤：
36.s1.获取茉莉花；
37.s2.从所述茉莉花中提取出黄酮，后进行酶解，得到茉莉花酶解液；
38.s3.向所述茉莉花酶解液中接种生产菌，并培养，得到细菌纤维素；其中，以质量浓度计，所述茉莉花酶解液的黄酮含量≤20mg qe/g。
39.本技术实施例中，可以使用废弃茉莉花或常规进行提取黄酮等操作，使废弃茉莉花变废为宝，实现资源的有效利用；也可以使用提取精油和/或提取黄酮后的所述茉莉花再次提取出黄酮，后进行酶解。
40.本技术实施例中，可以在提取黄酮中之前，先进行粉碎灭菌，接着提取黄酮。
41.本技术实施例中向茉莉花残渣中接种霉菌(aspergillus niger)，产生纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶.
42.本技术实施例中酶解液中黄酮的含量与细菌生产素的关系图，如图7所示，当黄酮的含量较低时，细菌纤维素产量较高。本试验采用nano2‑
alcl3‑
naoh方法，以槲皮素为标样，绘制标准曲线。取1ml 0.06
‑
0.30mg/ml的槲皮素溶液于试管中，加入600μl蒸馏水、300μl 5％亚硝酸钠溶液，混匀，避光反应6min后，加入600μl 10％三氯化铝溶液，混匀；避光反应5min后，加入2ml 4％氢氧化钠溶液，1.1ml蒸馏水，混匀后立即于510nm测定吸光度，以蒸馏水代替样品溶液做空白对照，得到槲皮素质量浓度y(mg/ml)与吸光度a的回归方程为：y＝1.5709a
‑
0.009(r2＝0.9941)，计算样品中的总黄酮含量，结果以槲皮素当量(quercetin equivalents，qe)表示，单位为mg qe/g。
43.本技术实施例中，用废弃茉莉花培养生产的细菌纤维素替代了常规培养使用的成本较高的可发酵糖或椰子水，降低了成本。发酵过程中使用了从废弃茉莉花中酶解后得到水解物。在所有情况下，初始还原糖浓度都在20g/l。
44.本技术实施例中细菌纤维素具有以下特性：
45.纳米级纤维：细菌纤维素的微纤维组成独特的束状纤维，宽度100nm左右，厚度为3～8nm，是目前最细的天然纤维，其大小仅为人工合成纤维的1/10；
46.高结晶度和高化学纯度：细菌纤维素以100％纤维素的形式存在，不含半纤维素、木质素和其它成分，提纯过程简单。
47.高抗张强度和弹性模量：细菌纤维素经洗涤、干燥后，杨氏模量可达10mpa，经热压处理后，杨氏模量可达30mpa，比有机合成纤维的强度高4倍。
48.高持水量(或称高亲水性)：细菌纤维素能吸收60～700倍于其干重的水份；极佳的形状维持能力和抗撕力：细菌纤维素膜的抗撕能力比聚乙烯膜和聚氯乙烯膜要强5倍；
49.较高的生物适应性和良好的生物降解性：自然环境中，在酸性、微生物以及纤维素酶催化等条件下可以最终降解成单糖等小分子物质；
50.抗菌性：常规生产的细菌纤维素没有抗菌性，需要经过一系列修饰和再加工，从而获得抗菌性，生产工艺复杂，成本增加，而在本技术中，直接由生产菌生产获得，制备简单，成本低。
51.本技术实施例中，预处理可以用酸进行处理，而在高温条件下酸和茉莉花反应会产生副产物，来抑制细菌纤维素的生产。本技术可以不用酸进行处理，促进细菌纤维素的生产。
52.本技术实施例中，茉莉花中含有很丰富的营养物质，足以提供细菌纤维素发酵所需的碳源和氮源，是很好的发酵底物。同时在发酵之前先提取黄酮，降低黄酮对bc产量的抑制，之后再用霉菌(aspergillus niger)分解废弃茉莉花产生的多种水解酶，来降解废弃茉莉花产生培养细菌纤维素所必需的营养物质，替代了传统的用酸或碱水解，进一步减少了对bc培养的抑制作用。
53.作为一种可选的实施方式，所述茉莉花为提取茉莉花精油和/或提取茉莉花黄酮后的残渣。
54.本技术实施例中，所述茉莉花可以是普通茉莉花植物的根、茎、叶、花，将茉莉花植物的根、茎、叶、花的粉末超声波条件下，可以用50％乙醇水溶液，物料比可以为1：13，120w可以为功率，50℃、40min，总黄酮得率为2.26％。
55.作为一种可选的实施方式，所述从所述茉莉花中提取出黄酮包括：在超声波和醇水溶液的条件下从所述茉莉花中提取出黄酮。
56.本技术实施例中，提取茉莉花精油包括；用酶解法辅助水蒸汽蒸馏法提取茉莉花精油，添加果胶酶和纤维素酶的复合酶体系，酶用量可以为3000u/g，酶解温度可以为50℃，酶解ph可以为5.5，所得精油得率为0.2439％。
57.本技术实施例中，提取茉莉花黄酮包括：向茉莉花的废弃残渣中可以加入2％的氢氧化钠溶液，煮沸约30分钟，静置冷却；加入十倍容积的去离子水搅拌再生，过滤得到沉淀，再用去离子水洗涤，直至溶液上清，将得到的上清液或者过滤得到的滤液置于蒸馏瓶中，可以在温度100
‑
170℃下常压蒸馏或者可以在温度50
‑
150℃和
‑
0.09～
‑
0.1mpa的真空度条件下减压蒸馏，去除与离子液体共混的水，蒸馏至蒸不出水为止，蒸馏瓶中剩余的即为回收的离子液体；其中，蒸馏过程中冷凝管所用冷却液可以为10℃以下的冷却液，连接真空泵前的系统中加装一个冷阱，冷阱置于盛有液氮冷却剂的保温瓶中。
58.作为一种可选的实施方式，所述酶解包括：
59.在所述茉莉花残渣中加入酸性缓冲液，后加入纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶，进行酶解反应，得到酶解液。
60.本实施例中，向上述沉淀或滤渣中加入醋酸缓冲溶液至固液比为0.01g∶1ml，再加入纤维素酶、半纤维素酶，蛋白酶，调节ph至5，在50℃条件下反应48h，离心分离上清获得酶
解液。所述茉莉花的沉淀和所述酸性缓冲液的固液比为0.01g∶1ml。
61.本技术实施例中，加入酸性缓冲液的目的是维持ph值恒定，确保酶解正常进行。
62.本技术实施例中，所述酶解中，温度为50℃，ph为5，时间为48h。
63.作为一种可选的实施方式，所述茉莉花的沉淀和所述酸性缓冲液的固液比为0.005g∶1ml～1g∶10ml。
64.作为一种可选的实施方式，所述酶解液中酶终浓度包括：纤维素酶活的浓度可以为850
‑
1000u/g、蛋白酶的浓度可以为46000
‑
48000u/g和木聚糖酶活的浓度可以为92000
‑
94000u/g。
65.本技术实施例中，所述纤维素酶活的浓度可以为938u/g、酸性蛋白酶的浓度可以为47274u/g和木聚糖酶活的浓度可以为93831.8u/g
66.作为一种可选的实施方式，所述酶解的温度为40
‑
60℃，ph为4.0
‑
5.5，时间为24
‑
48h。
67.作为一种可选的实施方式，所述生产菌：木糖驹形氏杆菌(komagataeibacter xylinus)或木醋杆菌。
68.本实施例中，将上述方法制备的酶解液直接作为培养细菌纤维素的培养基，再加入8％细菌纤维素生产菌的种子液，可以在30℃静置培养7天得到细菌纤维素。
69.第二方面，本技术提供了一种由上述的方法制得的细菌纤维素，具有抗菌性和抗氧化性，相比常规抗菌性和抗氧化性细菌纤维素，无需进行改性或加工，本技术中细菌纤维素直接由生产菌产出，制备方法简单。
70.一种上述的制备方法在制备细菌纤维素或利用废弃茉莉花中的应用。
71.实施例1
72.废弃茉莉花提取黄酮后之后产量达到80
‑
90％，提取黄酮：将100g废弃茉莉花研磨成粉末，之后在超声波条件下，用70％乙醇水溶液，物料比为1：13，120w，50℃、40min，总黄酮得率为20.98
±
1.03(mg qe/g)；接种霉菌(aspergillus niger)：向上述沉淀中接种霉菌(aspergillus niger)，在28℃下反应2
‑
3天，待其产生纤维素酶、半纤维素酶，蛋白酶。酶解：剩余的固体部分富含纤维素，半纤维素及蛋白质，向上述沉淀或滤渣中加入醋酸缓冲溶液至固液比为0.01g∶1ml，再加入上述步骤产生的纤维素酶、半纤维素酶，蛋白酶，调节ph至5，在50℃条件下反应48h，离心分离上清获得酶解液。酶解液制备细菌纤维素：将上述方法制备的酶解液直接作为培养细菌纤维素的培养基，发酵过程中使用了从茉莉花废料中直接获得的游离糖与酶解后得到的水解物，加入8％木糖驹形氏杆菌的种子液，30℃静置培养7天得到细菌纤维素。继续培养：取出细菌纤维素膜之后，将剩余的培养液加入步骤二中继续培养霉菌，使其产生纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶。
73.实施例2
74.废弃茉莉花提取黄酮后之后产量达到80
‑
90％，提取步骤如图8所示，初步提取：连续两次的水萃取，向90g废弃茉莉花中加入去离子水(1h，40℃，180rpm)，初步提取可溶于水的小分子糖及氨基酸。接种霉菌：同时取10g未经提取的废弃茉莉花，向其中接种霉菌，在28℃下反应2
‑
3天，待其产生纤维素酶、半纤维素酶，蛋白酶。提取黄酮：萃取后的茉莉花粉末在超声波条件下，用70％乙醇水溶液，物料比为1：13，120w，50℃、40min，总黄酮得率为5.516％。酶解：剩余的固体部分富含纤维素，半纤维素及蛋白质，向上述沉淀或滤渣中加入
缓冲溶液至固液比为0.01g∶1ml，再加入上述步骤产生的纤维素酶、半纤维素酶，蛋白酶，调节ph至5，在50℃条件下反应48h，将酶解液于4℃冷藏。酶解液制备细菌纤维素：将上述方法制备的酶解液直接作为培养细菌纤维素的培养基，发酵过程中使用了从茉莉花废料中直接获得的游离糖与酶解后得到的水解物，加入8％木醋杆菌的种子液，30℃静置培养21天得到细菌纤维素。继续培养：得到细菌纤维素膜之后，将剩余的培养液继续培养霉菌，使其产生纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶。
75.对比例1
76.拿茉莉花水解培养细菌纤维素产量可能只有hs培养基的20
‑
30％。hs培养基，葡萄糖20.0g/l、蛋白胨5.0g/l、酵母粉5.0g/l、无水na2hp042.7g/l、一水合柠檬酸1.15g/l，培养好的菌种以8％接种量接于装有100ml发酵培养基的250ml锥形瓶中，30℃培养96h。用hs培养基替换酶解液直接作为培养细菌纤维素的培养基，其他同实施例1。
77.相关实验
78.由图1的傅里叶变换红外(ft
‑
ir)中可以看到，茉莉水解液制备的细菌纤维素膜(ml)具有本实验室配方制备的细菌纤维素膜(hs)的特征峰。在3340cm
‑1处为
‑
oh的伸缩振动吸收峰，峰带宽而且强，说明两者表面都含有大量的
‑
oh；2910cm
‑1处为细菌纤维素的c
‑
h伸缩振动峰；1650cm
‑1处是由于糖类物质4端的半缩醛基团引起的；1425cm
‑1处的吸收峰为
‑
ch2‑
的对称弯曲振动峰；1040cm
‑1处的吸收峰为糖环的c
‑
o
‑
c和c
‑
o
‑
h的伸缩振动峰，而890cm1处的吸收峰则为纤维素β
‑1，4糖苷键的特征吸收峰。不同的是，ml在1650
‑
1040cm
‑1之间出现了许多尖锐的新峰，主要的吸收峰有：1600cm
‑1以及1500cm
‑1处为苯环骨架的特征吸收峰，1170cm
‑1为苯环上c
‑
o
‑
h的吸收峰，另外，ml在1650cm
‑1的峰型比hs在此处的峰型尖锐，强度大，推测可能是水解液中黄酮类物质所致。
79.抗氧化能力测定：
80.采用frap法。frap试剂由300mmollph3.6酸性缓冲液、10mmoll tptz(溶于40mmolil盐酸)、20mmoll三氯化铁混合制成。取100ul待测样品.加入3.6m lfrap试剂、360ul蒸馏水，充分混匀在37℃水浴反应60min后于593nm测定吸光度。以vc为标样，绘制标准曲线，得到vc摩尔质量浓度y(umolm l)与吸光度a的回归方程为y＝2.6682a
‑
0.0093(r2＝0.9993)。各样品的抗氧化活性以达到同等吸光度所需vc的微摩尔数表示，记为frap值，单位为umol
·
vc/g。最后测得本技术实施例1的抗氧化性值y＝28.98umol
·
vc/g。
81.图2为ml和hs的xrd图。ml和hs衍射角的顶点22.8
°
，和14.68
°
的衍射角，而16.86
°
、27.39
°
和34.28
°
的峰只有mh
‑
bc具有。由此可见，ml不仅包含细菌纤维素的特征峰，还具有黄酮类化合物的特征峰。
82.从图3和图4中可以看出，ml的热降解曲线与hs的热降解曲线相似。由三个区域组成，第一个区域的轻微重量损失是由于样品中的水随着温度的升高而蒸发。200到360℃之间的第二次重量损失是由于去除了小分子量部分，例如纤维素的羟基。在360到600℃之间发生的第三次重量损失是由于聚合物链和吡喃结构的降解。
83.在图5中，左图用实施例1的细菌纤维素在固体琼脂培养基上进行画圈，左侧中大肠杆菌出现明显的抑菌圈；右图用对比例1的细菌纤维素在固体琼脂培养基上进行画圈，右侧中大肠杆菌没有出现的抑菌圈。
84.在图6中，左图用实施例1的细菌纤维素在固体琼脂培养基上进行画圈，左侧中金
黄色葡萄球菌出现明显的抑菌圈；右图用对比例1的细菌纤维素在固体琼脂培养基上进行画圈，右侧中金黄色葡萄球菌没有出现的抑菌圈。
85.图5和图6，左图中两类细菌生长良好，而中间有明显的抑菌圈，说明本技术的细菌纤维素无需进行额外处理加工，抗菌性可直接获得。
86.本技术实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
87.(1)本技术实施例中，得到细菌纤维素膜之后，将剩余的培养液继续培养霉菌，使其产生纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶，整个过程没有任何废物产生，实现了对环境的零污染。
88.(2)本技术实施例中，接种霉菌：向茉莉花残渣中接种霉菌，在28℃下反应2
‑
3天，待其产生纤维素酶、半纤维素酶，蛋白酶，使本技术中需要的酶来源于相同的废弃茉莉花，灵活利用废弃茉莉花。
89.需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
90.以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。