一种含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸

1.本发明涉及靶向给药领域，尤其涉及一种反义寡核苷酸。


背景技术：

2.核酸类药物又称核苷酸类药物，是各种具有不同功能的寡聚核糖核苷酸(rna)或寡聚脱氧核糖核苷酸(dna)，主要在基因水平上发挥作用。由某些动物、微生物的细胞内提取出的核酸(包括核苷酸和脱氧核苷酸)，或者用人工合成法制备的具有核酸结构(包括核苷酸和脱氧核苷酸结构同时又具有一定药理作用的物质，称为核酸药物或核酸类生化药物、广义的核酸药物可包括核苷酸药物、核酸药物及含有不同碱基化合物的药物。核酸药物具有多种药理作用，按其作用特点可分为:(1)抗病毒剂(2)抗肿瘤剂(3)干扰素诱导剂(4)免疫增强剂(5)功能剂等。一般认为，核酸药物包括核酸适体(aptamer)、抗基因(antigene)、核酶(ribozyme)、反义核酸(antisencenucleic acid)、rna干扰剂。短链的dna或rna被称为寡聚核苷酸，其可以通过固相合成技术大规模合成。当前有多种寡聚核苷酸类药物被开发用于疾病的治疗，如sirna，microrna，mrna，反义寡核苷酸(aso)，核酸适体药物等。
3.其中，反义寡核苷酸(aso)药物近年来发展迅猛。反义寡核苷酸(aso)是一类通过序列特异地与靶基因dna或mrna结合而抑制该基因表达,在基因水平调控的分子药物。在合成这一类反义寡核苷酸中,常常需要对合成产物的长度,纯度等进行准确测定,以免影响后一步的活性实验和使用效果。毛细管凝胶或流动胶电泳方法已被广泛应用于单链或双链寡核苷酸的分离研究。目前，已市面上有几款反义寡核苷酸药物被美国食品药品管理局(fda)批准用于相关疾病的治疗(福米韦生，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎；kynamro，用于治疗家族性高胆固醇血症)。其主要通过与靶基因的dna或mrna特异结合而抑制基因的表达来发挥功能。
4.但是，在临床试验及实践中，反义寡核苷酸药物常存在血液凝固异常，血小板减少以及肾脏损害等风险。此外，反义寡核苷酸的较多药物稳定性低，具有一定程度的脱靶性，它们的脱靶往往会导致内源正常mrna在翻译前水平的非正常降解，因此，其靶向药物活性较低，肾清除率较高，最终导致该药物在体内的半衰期短，需要较频繁地进行给药。由此可见，传统反义寡核苷酸疗法的发展并非一帆风顺。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题至少之一，本发明提供一种经过三氟甲基碱基类似物修饰改性的反义寡核苷酸，它克服了寡核苷酸在血清中易被核酸酶降解的特性。
6.上述的一种含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸经一个或多个双三氟甲基苯核苷酸插入和/或置换，和/或反义寡核苷酸末端连接修饰一个或多个双三氟甲基苯核苷酸。
7.上述含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸中，末端连接修饰一个或多个双三氟
甲基苯核苷酸。
8.上述含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸中，所述反义寡核苷酸末端连接修饰两个双三氟甲基苯核苷酸。
9.上述含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸中，所述反义寡核苷酸为aso-kras，其序列如seq id no.:1所示。
10.上述含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸中，所述反义寡核苷酸为aso-egfr，其序列如seq id no.:2所示。
11.上述含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸中，所述反义寡核苷酸经药物碱基修饰；优选地，所述药物碱基为5-fu(5-氟尿嘧啶)、吉西他滨(gems)、阿霉素、顺铂，优选地，所述药物碱基为5-fu(5-氟尿嘧啶)、吉西他滨(gems)。
12.上述含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸中，所述药物碱基替换所述反义寡核苷酸aso-kras的第14位(胸腺嘧啶)、第15位(胞嘧啶)中的一个或多个；所述药物碱基替换所述反义寡核苷酸aso-egfr的第3位(胸腺嘧啶)、第7位(胸腺嘧啶)、第19位(胞嘧啶)中的一个或多个。
13.上述含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸中，所述反义寡核苷酸经荧光分子化合物修饰，优选地，所述反义寡核苷酸经cy5(cyanine5)修饰。
14.本发明还涉及一种药物组合物，其包括前述的含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸，以及医学和/或药学上可接受的赋形剂。所述药物组合物用作靶向给药。
15.本发明的优点和有益效果在于：
16.本发明提供了一种含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸，采用三氟甲基苯核苷酸对反义寡核苷酸进行插入、置换或修饰，最终达到了增强核酸对与血浆蛋白之间的结合、改善核酸稳定性、改善核酸成药性及药物半衰期的目的。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1是本发明实施例1反义寡核苷酸血清稳定性测试结果示意图；
19.图2是本发明实施例1反义寡核苷酸干扰效果测试结果示意图；
20.图3是本发明实施例1反义寡核苷酸在标靶部位浓度测试结果示意图；
21.图4是本发明实施例1反义寡核苷酸在标靶部位浓度测试结果示意图；
22.图5是本发明实施例1反义寡核苷酸细胞毒性测试结果示意图；
23.图6是本发明实施例2反义寡核苷酸血清稳定性测试结果示意图；
24.图7是本发明实施例2反义寡核苷酸干扰效果测试结果示意图；
25.图8是本发明实施例2反义寡核苷酸在标靶部位浓度测试结果示意图；
26.图9是本发明实施例2反义寡核苷酸在标靶部位浓度测试结果示意图；
27.图10是本发明实施例2反义寡核苷酸细胞毒性测试结果示意图。
具体实施方式
28.下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
29.反义寡核苷酸
30.本发明记载了一种含有三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸，此种反义寡核苷酸可将一个或多个双三氟甲基苯核苷酸插入其序列中或者将其置换。在一种实施例中，可将反义寡核苷酸末端连接修饰一个或多个双三氟甲基苯核苷酸，其中，本领域操作人员可根据实际需求决定插入或替换的双三氟甲基苯核苷酸基团数量。
31.例如，可将一个或多个双三氟甲基苯核苷酸插入所述反义寡核苷酸的中间位置或末端位置，作为一种优选方案可将其连接修饰于反义寡核苷酸末端。本发明所记载的反义寡核苷酸可选自aso-kras(其序列为seq id no.:1：5
′‑
ctacgccacgagctcca-3
′
)、aso-egfr(其序列为seq id no.:2：5
′‑
tttcttttcctccagagcccg-3
′
)的一种或其组合，但不排除使用本领域常用的其它反义寡核苷酸，如aso-p53、aso-cmv等。
32.本发明所记载的反义寡核苷酸可分别在aso-kras、aso-egfr序列两端分别连接修饰一个或多个双三氟甲基苯核苷酸，优选地，作为本发明的一种实施例，可在aso-kras或aso-egfr序列两端分别连接修饰一个或两个双三氟甲基苯核苷酸(其中一种序列可见表1中aso-kras-1序列或aso-egfr-1序列)。
33.其中，本发明所记载的反义寡核苷酸aso-kras中的kras为k-ras，k-ras是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是ras基因家族成员之一，编码k-ras蛋白(21kda)。含有4个编码外显子和1个5’端非编码外显子，共同编码含189个氨基酸的ras蛋白。是表皮生长因子受体功能信号的下游分子。与肿瘤的生成，增殖，迁移，扩散以及血管生成均有关系。
34.本发明所记载的反义寡核苷酸aso-egfr中的egfr(epidermal growth factor receptor)是上皮生长因子(egf)细胞增殖和信号传导的受体。egfr属于erbb受体家族的一种，该家族包括egfr(erbb-1),her2/c-neu(erbb-2),her 3(erbb-3)和her 4(erbb-4)。egfr是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170kda，其突变或过表达一般会引发肿瘤。egfr位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，包括egf和tgfα(transforming growth factorα)。egfr广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，egfr信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。研究表明在许多实体肿瘤中存在egfr的高表达或异常表达，因此，egfr与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。
35.需要注意的是，本发明所记载的egfr与kras基因检测二者密切相关。kras蛋白处于egfr信号通路通路的下游。在正常生理情况下，egfr信号通路被活化后，kras蛋白短暂激活，其后迅速失活，kras激活/失活效应是受控的。而kras基因突变时，可以导致egfr信号通路持续激活，加速肿瘤细胞增殖。kras基因突变96％发生在第2号外显子的12、13号密码子。20％的非小细胞肺癌(nsclc)、30-35％的大肠癌患者中存在kras基因突变。k-ras突变型编码异常的蛋白，刺激促进恶性肿瘤细胞的生长和扩散；并且不受上游egfr的信号影响，所以对抗egfr治疗效果差。kras基因检测可以筛选出egfr靶向治疗药物有效的大肠癌患者，帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法，实现肿瘤病人的个体化治疗。大肠癌患者k-ras基因突变异常的概率为30％-35％。检测k-ras基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各
种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。(参考文献：余元勋主编.中国分子肝癌学：中国分子医学系列丛书，2016.04：162-166)
36.同时，本发明所记载的含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸还可使用药物碱基进行修饰，药物碱基可根据实际治疗需要，选自但不限于5-fu(5-氟尿嘧啶)、吉西他滨(gems)、阿霉素、顺铂中的一种或多种，也可选自上述几种药物之外的本领域常用药物。作为一种实施例，可使用药物碱基替换反义寡核苷酸aso-kras的第14位(胸腺嘧啶)、第15位(胞嘧啶)中的一个或多个；所述药物碱基替换所述反义寡核苷酸aso-egfr的第3位(胸腺嘧啶)、第7位(胸腺嘧啶)、第19位(胞嘧啶)中的一个或多个。本发明已经研发出多种上述反义寡核苷酸序列(具体序列可参见实施例表1)。
37.在一个实施例中，为了测试三氟甲基碱基类似物修饰的反义寡核苷酸序列在体内的稳定性，可使用cy5(cyanine5)再次对该反义寡核苷酸进行修饰，之后通过荧光测试观察体内荧光信号强度，从而对其体内稳定性进行评价(具体操作步骤见后文实施例)。
38.药物组合物
39.本发明另一方面还涉及了一种药物组合物，该药物组合物包含上文所述的任何一种含三氟甲基碱基类似物的反义寡核苷酸以及一种或多种医学和/或药学上可接受的赋形剂药物组合物。
40.本文所用的“药物组合物”涉及生理上可耐受的组合物和分子实体。
41.术语“赋形剂”是指在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；中药丸剂中的酒、醋、药汁等；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
42.术语“医学和/或药学上可接受”，一般是指此赋形剂与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害、无生理作用，不与主药产生化学或物理作用，不影响主药的含量测定等。
43.优选地，上述药物组合物在临床治疗中可用于靶向给药。
44.在临床试验中，可使用cy5(cyanine5)再次对该反义寡核苷酸进行修饰，之后通过荧光测试观察体内荧光信号强度，从而对其体内稳定性进行评价(具体操作步骤见后文实施例)，从而进一步判断此种药物组合物的药物半衰期，以确定治疗时的给药间隔及给药剂量。
45.实施例
46.实施例1
47.本专利通过固相合成的方式将三氟甲基修饰于反义寡核苷酸(aso)的末端或中间位置构建了一系列不同的寡核苷酸，如表1所示。
48.名称序列aso-kras5
′‑
ctacgccacgagctcca-3
′
aso-kras-15
′‑
ffctacgccacgagctccaff-3
′
aso-kras-25
′‑
ffctacgccacgagc5-fuccaff-3
′
aso-kras-35
′‑
ffctacgccacgagctgemscaff-3
′
aso-egfr5
′‑
tttcttttcctccagagcccg-3
′
aso)体内稳定性。将cy5(cyanine5)修饰的f-aso序列(50um，100ul)通过尾静脉注射入小鼠体内，观察0-48小时内小鼠体内肿瘤部位荧光变化。结果显示，三氟甲基碱基类似物修饰的aso序列在肿瘤部位逐渐富集，且在48小时肾脏荧光消失后，肿瘤部位依然有很强的荧光信号。
65.4、产品对药物碱基细胞毒性的影响
66.如图10所示，接种h460细胞(肺癌细胞)至96孔板，分别加入三氟甲基碱基类似物修饰的aso序列(f-aso)及同时进行了5-fu或吉西他滨嵌合的aso序列。孵育48小时后，通过cck-8检测细胞活性。结果显示，进行三氟甲基碱基类似物修饰后，不影响吉西他滨或5-fu的细胞毒性。且与aso相比，f修饰的egfr aso其在100nm即有较好的毒性，而aso达到相同的毒性需要1000nm。
67.对所公开的实施例的上述说明，以便本技术领域的专业技术人员能够实现或使用本技术。针对这些实施例的多种修改，对本技术领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本技术的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本技术将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。