1.本发明涉及分离纯化技术领域，更具体地说，它涉及一种高纯度根皮苷的制备方法。
背景技术：
2.根皮苷是从苹果、苹果树皮及叶中提取而得，它是苹果树体内的酚类物质。根皮苷是由根皮素和配糖体为葡糖苷结合成的苷，它的降解产物根皮素，能有效抑制微生物活动的作用等。国内外的临床研究表明，根皮苷在治疗糖尿病方面有很好的疗效。
3.目前生产根皮苷的方法主要通过从苹果以及苹果的树皮，叶子，或者湖北海棠的枝叶中提取得到。目前市场上货量比较充足的是80%含量的根皮苷（hplc检测），纯度不高，有暗棕黄色色泽，因而限制了其应用于产品的使用，而95%含量以上的根皮苷价格高昂且货源不多。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种高纯度根皮苷的制备方法，其解决了现有的根皮苷纯度低、颜色为暗棕黄色做复配产品容易影响色泽的问题。
5.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种高纯度根皮苷的制备方法，包括如下步骤：1）：将待提纯的根皮苷原料溶解于少量浓度为35%~40%（体积比）的乙醇水溶液中，将该溶液作为上样液；2）：使用柱层析纯化1）中的上样液，先后依次用浓度为1%~5%的乙醇水溶液，浓度为50%~58%的乙醇水溶液作为洗脱溶剂进行洗脱；3）：收集浓度为50%~58%的乙醇水溶液洗脱层析柱的洗脱液，并减压浓缩至无醇味，冷却至室温，离心回收固体，得到提纯后的根皮苷。
6.进一步地，步骤1）中加入的乙醇水溶液的重量为所述根皮苷原料的重量的2~3.5倍。
7.进一步地，步骤1）中乙醇水溶液的温度为42℃~48℃。
8.进一步地，步骤2）中所述层析柱选用型号为xad1600或者xad16n的大孔树脂填料柱层析。
9.进一步地，步骤2）中依次用浓度为1%~5%的乙醇水溶液和浓度为50%~58%的乙醇水溶液洗脱层析柱具体包括：用浓度为1%~5%的乙醇水溶液洗脱2个柱体积，洗脱速率为2bv/h，洗脱液弃去；用浓度为50%~58%的乙醇水溶液洗脱3个柱体积，洗脱速率为2bv/h。
10.进一步地，所述待提纯的根皮苷原料纯度为80%-85%。
11.进一步地，所述提纯后的根皮苷的纯度高于98%。
12.进一步地，所述方法还包括如下步骤：4)：用浓度为95%的乙醇水溶液洗脱3个柱体积的层析柱（清洗层析柱填料）， 洗脱液浓缩回收乙醇。
13.综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明通过将低含量根皮苷原料溶解于乙醇水溶液中，利用低浓度的乙醇水溶液溶解水溶性强、极性大的杂质并去除，利用50%~58%
的乙醇水溶液洗脱层析柱大孔树脂填料中吸附的根皮苷，从而提取到高纯度的根皮苷，且提取到的根皮苷去除了含杂色的杂质，应用更加广泛。并用高浓度的乙醇水溶液洗脱除去层析柱中残留吸附的极性小的化合物，并浓缩去除杂质后可回收乙醇，本发明优化根皮苷的提取方法，简便易用，工艺环保，所得根皮苷纯度≥98%。
具体实施方式
14.根皮苷原料：市售80%纯度（三个批次），购自西安天广源生物科技有限公司。
15.根皮苷对照品：市售，品牌：phytolab，含量≥98%（hplc）。
16.实施例1：取50g待提纯的根皮苷原料，根皮苷原料的纯度81%（hplc检测纯度）；溶解于175ml温度为48℃的35%（体积比）的乙醇水溶液中，将该溶液作为上样液，并经xad1600型号的大孔树脂柱层析（柱体积为3l，柱直径为8cm）富集纯化，先用4.5l浓度为1.5%的乙醇水溶液洗脱层析柱，洗脱速率为2bv/h，洗脱液弃去；再用6l浓度为50%的乙醇水溶液洗脱层析柱，洗脱速率为2bv/h，收集洗脱液，并减压浓缩至无醇味，冷却至室温，8000r/min离心回收固体，得到提纯后的根皮苷，提纯后的根皮苷的纯度经hplc检测纯度为98.9%；再用浓度为6l的95%的乙醇水溶液洗脱层析柱，洗脱液浓缩回收乙醇。
17.根皮苷检测方法：仪器：agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱：c18，250mm*4.6mm，粒径5μm，流动相：乙腈：0.01%三氟乙酸水溶液=25：75，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，检测波长：254nm，进样体积：10μl。
18.实施例2：取50g待提纯的根皮苷原料，根皮苷原料的纯度83%（hplc检测纯度）；溶解于125ml温度为45℃的38%（体积比）的乙醇水溶液中，将该溶液作为上样液，并经xad16n型号的大孔树脂柱层析（柱体积为3l，柱直径为8cm）富集纯化，先用4.5l浓度为5%的乙醇水溶液洗脱层析柱，洗脱速率为2bv/h，洗脱液弃去；再用6l浓度为58%的乙醇水溶液洗脱层析柱，洗脱速率为2bv/h，收集洗脱液，并减压浓缩至无醇味，冷却至室温，8000r/min离心回收固体，得到提纯后的根皮苷，提纯后的根皮苷的纯度经hplc检测纯度为98.5%；再用浓度为6l的95%的乙醇水溶液洗脱层析柱， 洗脱液浓缩回收乙醇。根皮苷检测方法与实施例1一致。
19.实施例3：取50g待提纯的根皮苷原料，根皮苷原料的纯度85%（hplc检测纯度）；溶解于100ml温度为42℃的40%（体积比）的乙醇水溶液中，将该溶液作为上样液，并经xad16n型号的大孔树脂柱层析（柱体积为3l，柱直径为8cm）富集纯化，先用4.5l浓度为3%的乙醇水溶液洗脱层析柱，洗脱速率为2bv/h，洗脱液弃去；再用6l浓度为55%的乙醇水溶液洗脱层析柱，洗脱速率为2bv/h，收集洗脱液，并减压浓缩至无醇味，冷却至室温，8000r/min离心回收固体，得到提纯后的根皮苷，提纯后的根皮苷的纯度经hplc检测纯度为99.3%；再用浓度为6l的95%的乙醇水溶液洗脱层析柱， 洗脱液浓缩回收乙醇。根皮苷检测方法与实施例1一致。
20.本实施例通过将低含量根皮苷原料溶解于乙醇水溶液中，利用低浓度的乙醇水溶液溶解水溶性强、极性大的杂质并去除，利用50%~58%的乙醇水溶液洗脱根皮苷，从而提取得到高纯度的根皮苷，且提取到的根皮苷去除了含杂色的杂质，有更加广泛的应用途径。并用高浓度的乙醇水溶液洗脱除去层析柱中极性小的化合物，并浓缩去除杂质后可回收乙
醇，本实施例根皮苷的提取方法，简便易用，工艺环保，所得根皮苷纯度≥98%。
21.以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种高纯度根皮苷的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）：将待提纯的根皮苷原料溶解于少量浓度为35%~40%的乙醇水溶液中，将该溶液作为上样液；2）：使用柱层析纯化1）中的上样液，先后依次用浓度为1%~5%的乙醇水溶液，浓度为50%~58%的乙醇水溶液作为洗脱溶剂进行洗脱；3）：收集浓度为50%~58%的乙醇水溶液洗脱层析柱的洗脱液，并减压浓缩至无醇味，冷却至室温，离心回收固体，得到提纯后的根皮苷。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中加入的乙醇水溶液的重量为所述根皮苷原料的重量的2~3.5倍。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中乙醇水溶液的温度为42℃~48℃。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述层析柱选用型号为xad1600或者xad16n的大孔树脂柱层析。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中依次用浓度为1%~5%的乙醇水溶液和浓度为50%~58%的乙醇水溶液洗脱层析柱具体包括：用浓度为1%~5%的乙醇水溶液洗脱1.5个柱体积，洗脱速率为2bv/h，洗脱液弃去；用浓度为50%~58%的乙醇水溶液洗脱3个柱体积，洗脱速率为2bv/h。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于， 所述待提纯的根皮苷原料纯度为80%~85%。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提纯后的根皮苷的纯度高于98%。
技术总结
本申请涉及一种高纯度根皮苷的制备方法，包括如下步骤：1）：取待提纯的根皮苷原料溶解于少量浓度为35%~40%的乙醇水溶液中，将该溶液作为上样液；2）：使用柱层析纯化，先后依次用浓度为1%~5%的乙醇水溶液，浓度为50~58%的乙醇水溶液进行洗脱；3）：收集浓度为50~58%的乙醇水溶液洗脱层析柱的洗脱液，并减压浓缩至无醇味，冷却至室温，离心回收固体，得到高纯度的根皮苷。根皮苷。
技术研发人员：夏增华 张小芸 徐洁
受保护的技术使用者：苏州禾研生物技术有限公司
技术研发日：2021.09.08
技术公布日：2023/3/9