一种基于CRISPR/Cas9获得MTHFR基因定点突变动物模型构建方法及其用途

一种基于crispr/cas9获得mthfr基因定点突变动物模型构建方法及其用途
技术领域
1.本发明涉及基因编辑领域，具体涉及一种基于crispr/cas9获得mthfr基因定点突变动物模型构建方法及其用途。


背景技术：

2.自1990年到2019年，全球卒中及中风死亡人数呈逐年上涨趋势。高血压、糖尿病、高血脂、肥胖、吸烟等为脑卒中的主要危险因素。但研究显示在同等程度血压升高状态下，中国人更容易发生脑卒中，研究发现，该现象与高血压人群普遍存在高同型半胱氨酸(hcy)及低叶酸的水平有关，血压与hcy同时升高的患者发生脑卒中的风险增至12.7倍。此外研究发现，高hcy水平与缺血性心脏病、深静脉血栓形成等心血管疾病风险增加相关。其可能的机制为hcy可通过促进氧化应激反应及血管内皮损伤、促进血栓形成、导致糖脂代谢紊乱等机制促进动脉粥样硬化的发生发展，最终显著增加心脑血管疾病风险。
3.环境因素和遗传因素共同影响hcy水平。既往研究提示性别、肾功能、b族维生素摄入量等环境因素，mthfr、mtrr、dept1、cbs基因多态性等遗传因素共同作用，最终造成hcy水平升高。基于中国汉族人群的全外显子组关联分析发现，mthfr基因c677t多态性是影响血浆hcy水平的最重要snp。亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)是叶酸代谢循环中的一种关键酶，mthfr基因c677t多态性碱基c到t的突变使mthfr酶耐热性下降，酶活性降低60％，导致hcy水平升高；与cc基因型相比，tt基因型个体的血hcy水平升高了约25％。
4.研究显示，mthfr-c677t基因多态性与国人脑卒中发病风险相关，tt基因型高血压患者卒中风险增加10.6倍。mthfr-c677t基因多态性亦可影响叶酸干预后的血清hcy和叶酸浓度。与cc/ct基因型人群相比，补充叶酸后，tt基因型患者hcy水平下降更为显著，但血清叶酸浓度和hcy水平达标(叶酸≥15ng/ml，hcy《10μmol/ml)的比例在tt基因型人群中最低，也即tt基因型患者需要更大剂量的叶酸来弥补叶酸水平的不足，才能使hcy充分降低。tt基因型高血压患者补充叶酸后新发脑卒中的降低幅度升高至28％，并且在基线高叶酸人群中可达76％。因此，对于不同mthfr基因多态性人群给予不同剂量叶酸的精准干预，很有可能为人群带来更大获益。采用基因工程技术构建模拟人类mthfr基因c677t多态性的基因工程动物有望成为解决此科学问题的关键。
5.从上述既往研究可知，补充叶酸作为降低hcy的有效治疗手段，可以显著降低我国高血压人群脑卒中风险，但不同mtfhr-c677t基因型高血压人群补充叶酸降低hcy和脑卒中预防的效果存在差异，因此根据基因型优化叶酸的剂量是十分必要的。目前，国内外用于研究高同型半胱氨酸血症与心血管疾病相关性的基因工程动物为mthfr基因杂合性敲除小鼠，但其从分子遗传学层面无法完全模拟人群中mthfr-c677t基因多态性。mthfr基因杂合性敲除相较点突变，可能会对机体产生更为严重甚至不可控的影响，因此，mthfr杂合性敲除小鼠并非是研究人类高同型半胱氨酸血症及卒中风险的理想模型。


技术实现要素：

6.因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于crispr/cas9获得mthfr基因定点突变动物模型构建方法及其用途，构建的所述动物模型能够可以完全模拟人类mthfr基因c677t多态性，且不会为机体及后续研究结果引入不可控影响，因此该模型为研究mthfr-c677t不同基因型背景人群高同型半胱氨酸血症以及心脑血管疾病的理想载体。
7.为此，本发明提供了如下的技术方案：
8.一种基于crispr/cas9获得mthfr基因定点突变动物模型的构建方法，包括如下步骤：
9.(1)基于目标基因mthfr设计sgrna；
10.(2)根据所述的sgrna序列设计供体寡核苷酸供体dna(donor dna)；
11.(3)将sgrna、cas9 mrna和供体dna的混合物注射入鼠受精卵中，将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠子宫中，出生的小鼠为被编辑的f0代小鼠，通过基因型筛选将所述f0代小鼠划分为野生型小鼠或阳性杂合子小鼠，然后将所述阳性杂合子小鼠与野生型小鼠进行交配，获得f1代小鼠，再次通过基因型筛选后得到的阳性子代小鼠为f1代杂合子，然后将f1代杂合子进行杂交繁育，最后将繁育所得的后代进行基因型鉴定获得杂合型突变小鼠、纯合型突变小鼠和野生型小鼠。
12.可选的，所述sgrna的序列如seq id no.1所示；和/或
13.所述供体dna的序列如seq id no.2所示。
14.可选的，所述sgrna、cas9 mrna和供体dna的混合物中，sgrna的浓度为12.5ng/μl，cas9 mrna的浓度为25ng/μl，供体dna的浓度为12.5ng/μl。
15.可选的，所述基因型鉴定或筛选步骤中，繁育的小鼠出生后1-2周剪尾并收集鼠尾，抽提基因组dna，通过pcr反应，将得到的pcr产物进行测序，进行基因型鉴定或筛选。
16.可选的，所述基因型鉴定或筛选步骤中，所述pcr反应中采用的引物对中，正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述测序步骤中采用的引物对中，正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
17.可选的，所述pcr的反应体系，以50μl为计：
18.gdna模板(template)2μl；
19.正向引物，10μm，2μl；
20.反向引物，10μm，2μl；
21.dntps，2.5mm，6μl；
[0022]5×
longamp taq reaction，10μl；
[0023]
longamp taq dna聚合酶，2μl；
[0024]
ddh2o，26μl。
[0025]
可选的，所述pcr的程序为：94℃保持3min；94℃保持30s，60℃保持30s，65℃保持30s，33个循环；65℃保持10min；然后保存。
[0026]
可选的，将pcr扩增产物进行测序，得到小鼠的基因型。
[0027]
所述的基于crispr/cas9获得mthfr基因定点突变动物模型的构建方法构建得到的动物模型在制备研究高同型半胱氨酸血症及心血管病的产品中的用途。
[0028]
本发明技术方案，具有如下优点：
[0029]
1.本发明提供的一种基于crispr/cas9获得mthfr基因定点突变动物模型的构建方法，包括如下步骤：(1)基于目标基因mthfr设计sgrna；(2)根据所述的sgrna序列设计供体寡核苷酸供体dna；(3)将sgrna、cas9 mrna和供体dna的混合物注射入鼠受精卵中，将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠子宫中，出生的小鼠为被编辑的f0代小鼠，通过基因型筛选将所述f0代小鼠划分为野生型小鼠或阳性杂合子小鼠，然后将所述阳性杂合子小鼠与野生型小鼠进行交配，获得f1代小鼠，再次通过基因型筛选后得到的阳性子代小鼠为f1代杂合子，然后将f1代杂合子进行杂交繁育，最后将繁育所得的后代进行基因型鉴定获得杂合型突变小鼠、纯合型突变小鼠和野生型小鼠；上述方法构建的动物模型可以完全模拟人类mthfr基因c677t多态性，且不会为机体及后续研究结果引入不可控影响，因此该模型为研究mthfr-c677t不同基因型背景人群高同型半胱氨酸血症以及心脑血管疾病的理想载体；
[0030]
此外，本发明方法构建的动物模型可控性高、重复性好、易于繁殖饲养，弥补了现有动物模型的不足，且更稳定、更加符合临床特点，为高同型半胱氨酸血症及动脉粥样硬化相管的发病机制及干预研究提供了良好的基础。利用此动物模型，可以为高同型半胱氨酸血症及动脉粥样硬化相关研究提供更加深入的见解；
[0031]
进一步的，本发明的方法可简单高效的进行基因位点精确编辑。
附图说明
[0032]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033]
图1是本发明实施例中基因型筛选示意图；
[0034]
图2是本发明实施例中基因型筛选中pcr扩增产物电泳结果；
[0035]
图3是本发明实施例中基因型筛选中pcr扩增产物测序验证示意图；
[0036]
图4是本发明实施例中基因型筛选中pcr扩增产物测序结果；
[0037]
图5是本发明实施例中基因型鉴定中pcr扩增产物测序结果。
具体实施方式
[0038]
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
[0039]
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0040]
cas9 mrna购自thermo fisher，货号a29378；
[0041]
下述实施例中sgrna和供体dna的序列以及引物序列由thermofisher合成；
[0042]
te缓冲液购自thermo fisher:货号am9860；
[0043]
c57bl/6j小鼠单细胞受精卵购自赛业(广州)生物科技有限公司；
[0044]
下述实施例中的pcr扩增产物进行测序是委托赛业(广州)生物科技有限公司完成。
[0045]
下述实施例中的c57bl/6j小鼠的规格体重20-25g，8-10周龄。
[0046]
实施例基于crispr/cas9获得mthfr基因定点突变动物模型的构建方法
[0047]
(1)、查阅ncbi数据库可知:c677t位点的dbsnp编号为rs1801133，该位点在转录本nm 005957.5中对应c.665c》t，其中人源nm_005957.5和鼠源m010840.3转录本的同源性最高，碱基序列相似度87％，氨基酸序列相似度90％。人源基因nm_005957.5(.665ct)的转录本氨基酸为a.222，对应鼠源nm_010840.3(c.662c》t)转录本氨基酸为a.221，鉴于此2个转录本同源性非常高，且氨基酸序列改变处于同蛋白质结构域，因此，本发明选择小鼠来构建基于crispr/cas9获得mthfr基因定点突变动物模型。
[0048]
(2)、sgrna和供体dna：小鼠mthfr基因(genbank登录号：nm_010840.3；ensembl:ensmusg00000029009)位于小鼠4号染色体上。已鉴定出12个外显子，其中atg起始密码子位于外显子2，tga终止密码子位于外显子12，转录本氨基酸a221位于外显子5上，因此，外显子5被选为目标位点，根据目标位点设计的sgrna序列如seq id no.1所示，根据所述的sgrna序列设计供体寡核苷酸供体dna如seq id no.2所示，所述供体寡核苷酸供体dna中的p.a221v(gcc到gtc)将通过同源性定向修复引入外显子5，同义突变p.f223＝(ttc到ttt)也被引入以防止同源定向修复后grna结合和重新切割序列，也引入sali限制酶切割位点将用于基因分型。
[0049]
(3)将sgrna、cas9 mrna和供体dna加入te缓冲液中进行稀释，得到的混合物中，sgrna的浓度为12.5ng/μl，cas9 mrna的浓度为25ng/μl，供体dna的浓度为12.5ng/μl，使用显微注射仪将上述混合物注射到c57bl/6j小鼠单细胞受精卵胞浆中，然后将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠(c57bl/6j小鼠)子宫中，出生的小鼠为被编辑的f0代小鼠，繁育的小鼠出生1周后，剪尾并收集鼠尾，抽提基因组dna，通过pcr反应，进行基因型筛选(正向和反向引物分别如seq id no3-4所示)，pcr反应体系如下：
[0050]
表1、pcr反应体系
[0051] 体积gdna模板(template)2μl正向引物(10μm)2μl反向引物(10μm)2μldntps(2.5mm)6μl5
×
longamp taq reaction10μllongamp taq dna聚合酶2μlddh2o26μl总体积50μl
[0052]
所述pcr的程序为：94℃保持3min；94℃保持30s，60℃保持30s，65℃保持30s，33个循环；65℃保持10min；然后保存。
[0053]
将上述获得的pcr扩增产物进行测序由赛业(广州)生物科技有限公司完成。
[0054]
通过基因型筛选将所述f0代小鼠划分为野生型小鼠和阳性杂合子小鼠，然后将所述阳性杂合子小鼠与野生型小鼠进行交配，获得f1代小鼠，繁育的小鼠出生1周后，剪尾并收集鼠尾，抽提基因组dna，进行基因型筛选(示意图如图1所示)，pcr反应和测序(同上述)，pcr扩增产物通过电泳，电泳结果如图2所示，图中mt表示突变型，wt为野生型对照，泳道3、4、6、9为f1代小鼠的pcr扩增产物电泳结果，收集该条带的扩增产物进行测序验证，测序验证示意图见图3，测序结果如图4所示，f1代小鼠的泳道3、4、6、9的pcr产物具有p.a221v(gcc
→
gtc)突变和沉默突变(ttc
→
ttt)，通过基因型筛选后得到的阳性子代小鼠为f1代杂合子，然后将f1代杂合子进行杂交繁育，最后将繁育所得的后代(f2代)在出生1周后，剪尾并收集鼠尾，抽提基因组dna，进行基因型鉴定(引物如seq id no.5-6所示)，进行pcr反应和测序(体系和方法同上述基因型筛选中的)，测序结果见图5，通过上述基因型鉴定获得杂合型突变鼠、纯合型突变鼠和野生型小鼠。
[0055]
实验例1
[0056]
验证实施例1获得的f1代小鼠和f2代小鼠的hcy水平
[0057]
检测实施例1获得的f1代小鼠(包括mthfrc662t纯合子、mthfrc662t杂合子，野生型)的血hcy水平。采取小鼠眶静脉血液200ul，离心获得血清后，利用便携式hcy检测仪(深圳奥萨制药有限公司)，采用循环酶法测定血清hcy的浓度。结果见下表，说明mthfr基因纯合子hcy水平最高，杂合子次之，野生鼠hcy水平最低，三者具有统计学差异。
[0058]
表2
[0059][0060]
检测实施例1获得的f2代小鼠(包括mthfrc662t纯合子、mthfrc662t杂合子，野生型)的血hcy水平(采取小鼠眶静脉血液200ul，离心获得血清后利用便携式hcy检测仪(深圳奥萨制药有限公司)，采用循环酶法测定血清hcy的浓度)。检测结果见表，说明mthfr基因纯合子hcy水平最高，杂合子次之，野生鼠hcy水平最低，三者具有统计学差异。
[0061]
表3、总体
[0062][0063]
表4、雄鼠
[0064][0065][0066]
表5、雌鼠
[0067][0068]
综上，f1代、f2代小鼠mthfrc662t纯合子hcy水平最高，杂合子次之，野生型hcy水平最低，各基因型间存在统计学差异，这说明本发明的基于crispr/cas9获得mthfr基因定点突变动物模型构建成功。
[0069]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。