一种硫酸化大麻多糖、其制备方法、用途及产品与流程

1.本发明涉及医药技术领域，特别是硫酸化大麻多糖、其制备方法、用途及产品。


背景技术：

2.多糖(polysaccharide)又称多聚糖，分布于高等动物植物的细胞膜或微生物细胞壁中，是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，是自然界含量最丰富的生物多聚物，是构成生命活动四大基本物质之一，不仅为生物提供了骨架结构和能量来源，还广泛地参与了细胞的各种生命现象及生理过程的调节。随着分子生物学、免疫物质的化学研究与发展以及新药物资源的寻找与开发，多糖的研究越来越广泛的受到重视。可以通过化学、物理学及生物学等方法对多糖进行结构改造，使多糖的生物学活性明显增加。植物多糖因具有改善机体免疫功能、抗病毒、抗氧化、抑制肿瘤生长、抗衰老等广泛的生物活性，且具有绿色天然、毒副作用小、不易产生耐药性等特点，受到国内外学者的广泛研究。
3.癌症，亦称恶性肿瘤，为由控制细胞增殖机制失常所引起的疾病。伴随着环境的恶化等，癌症已经成为危害人类健康的严重疾病之一，攻克癌症一直是世界瞩目的研究课题。细胞增殖与凋亡的非平衡匹配及其转移扩散是恶性肿瘤发生的基础。细胞凋亡的干预即细胞增殖与凋亡的调控是肿瘤疾病治疗的重要途径和手段。在正常生理状态下，适时、适度的细胞凋亡调控对生物体清除衰老和具有潜在危险的细胞，维持基因组的稳定性和正常个体的发育是非常重要的，在肿瘤存在的情况下诱导肿瘤细胞凋亡可达到肿瘤治疗的目的。
4.氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子自由基产生过多，氧化程度超出氧化物清除能力，氧化系统和抗氧化系统动态失衡，从而导致组织损伤。在畜牧业生产链条中，因集约化养殖、营养不良、饲料发酵、长途运输及极端环境等因素引起的氧化应激，影响养殖业的发展，造成巨大的经济损失。为了解决氧化应激导致的生产问题，外源抗氧化剂的研究得到广泛开展。
5.人体在新陈代谢过程中会产生自由基，这种活性分子具有一个或几个不配对电子的原子团或原子，具有一定的稳定性、高氧化性和化学性质活泼等特点。正常情况下，自由基对细胞增殖、分化、凋亡、坏死有调节作用；依赖自由基和氧化过程才能使众多机体组织产生能量；机体的氧化与抗氧化处于动态的平衡。但各种外源性和内源性的氧化应激反应均会影响生物体内自由基动态平衡，尤其在机体出现病态时会产生过多的活性氧，导致机体处于氧化应激状态。机体内过多的自由基及其代谢产物引起细胞代谢功能障碍及损伤，过量的自由基攻击dna、蛋白质和碳水化合物等生物大分子，产生多种不同的后果，使得自由基与多种疾病的产生密切相关，如癌症、心血管疾病、类风湿关节炎及动脉粥样硬化等。此外，随年龄增加而发生的机体老化也与此密切相关。体内自由基一般可通过抗氧化剂清除。目前常用的抗氧化剂有叔丁基对甲氧酚制剂(bha)和丁基羟基甲苯(bht)。尽管bha和bht具有很好的抗氧化效果，但是随着环保意识的增强，人们开始怀疑这类化学合成的抗氧化剂可能诱发肝损伤并导致癌症。因此，从天然产物中寻找新型抗氧化剂是一个重要方向。
6.大量研究表明，许多植物及其有效成分具有一定的抗氧化作用，但是由于成分复
杂，质量难以控制，因此植物的抗氧化作用较弱，此效果并不理想。由此，现有的研究表示可以通过分离具有活性作用的多糖进行使用，且在此基础上，还可以通过多种方式提高分离得到的多糖的活性，以便充分发挥多糖的应用和价值。大麻多糖因具有改善机体免疫功能、抗病毒、抗氧化、抑制肿瘤生长、抗衰老等广泛的生物活性，且具有绿色天然、毒副作用小、不易产生耐药性等特点，受到国内外学者的广泛研究。需进一步对多糖的结构修饰进行研究，以提高多糖的活性。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种硫酸化大麻多糖、其制备方法、用途及产品。
8.本发明的目的之一是提供一种硫酸化大麻多糖，所述硫酸化大麻多糖的分子量在1000da至10000da之间，优选在2000da至5000da之间，更优选在3000da至5000da之间，取代度为0.13-0.27，优选为0.15-0.27，更优选0.27。
9.本发明的目的之二是提供一种硫酸化大麻多糖的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)取大麻多糖分散至酰胺类或吡啶类溶剂中，搅拌均匀，得到a溶液；
11.(2)氯磺酸于冰水浴中缓慢加入到dmf中，搅拌混合均匀，得到b溶液；
12.(3)将a溶液与b溶液混合进行反应，得到c溶液；
13.(4)反应结束后，c溶液降至室温，缓慢加入无水乙醇沉淀，离心去清液，沉淀溶于水，ph调至中性，透析，截留液醇沉，离心，沉淀干燥，得到硫酸化大麻多糖。
14.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(1)中，大麻多糖与酰胺类或吡啶类溶剂的质量体积比为1:20～50(g/ml)，其中，大麻多糖与酰胺类溶剂的质量体积比可以是1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50，大麻多糖与吡啶类溶剂的质量体积比可以是1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50，但并不仅限于所列举的比值，该比值范围内其他未列举的比值同样适用。
15.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(1)中，酰胺类溶剂为甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺中的一种或多种，即，所述酰胺类溶剂包括但不限于分别单独使用甲酰胺、乙酰胺或丙酰胺，也可以是甲酰胺与乙酰胺不限比例的混合溶液，也可以是甲酰胺与丙酰胺不限比例的混合溶液，也可以是乙酰胺与丙酰胺不限比例的混合溶液，还可以是甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺三者不限比例的混合溶液。
16.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(1)中，吡啶类溶剂为吡啶、甲基吡啶、乙基吡啶中的一种或多种，即，所述吡啶类溶剂包括但不限于分别单独使用吡啶、甲基吡啶或乙基吡啶，也可以是吡啶与甲基吡啶不限比例的混合溶液，也可以是吡啶与乙基吡啶不限比例的混合溶液，也可以是甲基吡啶与乙基吡啶不限比例的混合溶液，还可以是吡啶、甲基吡啶、乙基吡啶三者不限比例的混合溶液。
17.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(1)中，搅拌温度为30～80℃，其中，搅拌温度可以是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，优选45℃，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
18.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(1)中，搅拌时间为20～50min，其中，搅拌时间可以是20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min，优选50min，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
19.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(2)中，氯磺酸与dmf的体积比为1:3～8(ml/ml)，其中，氯磺酸与dmf的体积比可以是1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8，优选1:5，但并不仅限于所列举的比值，该比值范围内其他未列举的比值同样适用。
20.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(2)中，搅拌时间为30～40min，其中，搅拌时间可以是30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min、40min，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
21.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(3)中，a溶液中大麻多糖与b溶液中氯磺酸的质量体积比为1:1～10(g/ml)，其中a溶液中大麻多糖与b溶液中氯磺酸的质量比可以为1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5、1:10，优选1:4，但并不仅限于所列举的比值，该比值范围内其他未列举的比值同样适用。
22.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(3)中，反应温度为30～80℃，其中，反应温度可以是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，优选50℃，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
23.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(3)中，反应时间为2～8h，其中，反应时间可以是2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h，优选5h，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
24.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(3)中，反应过程采用超声强化以达到促进硫酸化合成的目的，超声探头的形式可以是聚能式或分散式，超声波作用于溶液体系的超声功率为1-10w/l溶液体系，超声波作用于溶液体系的超声功率可以是每升溶液接受1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w不同功率超声波刺激强化，其中，优选5w/l溶液体系，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
25.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(4)中，无水乙醇用量为4～6倍体积c溶液，其中，无水乙醇用量可以是4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍体积c溶液，优选4倍体积c溶液，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
26.根据本发明的硫酸化大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(4)中，
27.无水乙醇为预冷至0～4℃；
28.采用饱和naoh水溶液调ph至7；
29.透析所使用的透析膜分子量为300da-500da，截留液中主要为分子量1000da以上的硫酸化大麻多糖；
30.截留液醇沉至乙醇浓度为80％以上；
31.沉淀干燥方式为冷冻干燥或真空脉动干燥。
32.本发明还提供了大麻多糖的制备方法，包括以下步骤：
33.(i)大麻多糖的提取：大麻加水提取，过滤，清液浓缩，得到粗大麻多糖溶液；
34.(ii)大麻多糖的纯化：粗大麻多糖溶液加乙醇沉淀，固液分离收集沉淀，沉淀加水溶解，除杂，洗脱液上deae纤维素柱，用盐溶液洗脱，洗脱液脱盐，干燥，得精制大麻多糖。
35.根据本发明的大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(i)中，所述的大麻为大麻花叶
原料(鲜或干)或大麻花叶提取cbd之后的残渣。
36.根据本发明的大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(i)中，所述大麻与水的质量体积比为1:5～1:30(g/ml)，其中，大麻与水的质量体积比可以是1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30，优选1：15，但并不仅限于所列举的比值，该比值范围内其他未列举的比值同样适用。
37.根据本发明的大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(i)中，提取过程加入酶，强化提取过程，所述酶为纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶中的一种或多种。
38.根据本发明的大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(i)中，浓缩过程采用真空减压浓缩或膜浓缩，优选地，浓缩至固形物含量为10～30％，其中，浓缩至固形物含量为10％、15％、20％、25％、30％，优选浓缩至固形物含量为30％，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
39.根据本发明的大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(ii)中，粗大麻多糖溶液与乙醇的体积比为1:4～6(ml/ml)，其中，粗大麻多糖溶液与乙醇的体积比可以是1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6，但并不仅限于所列举的比值，该比值范围内其他未列举的比值同样适用。
40.根据本发明的大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(ii)中，乙醇浓度为80％～100％，其中，乙醇浓度可以为80％、85％、90％、95％、100％，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
41.根据本发明的大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(ii)中，除杂方式为大孔树脂除杂，其中所述的大孔树脂为d201、d900、201
×
7、d113、d72、d301、d-101、d318、d208、hpd-100、hpd300、hpd-600、hpd-100a、hpd-400a、hpd-722、dm301、ads-17、nhk、ads-8、ads-1、hz-818、hz-816、hz-835、ab-8、dm130、d312、hz-20ss、xda-8、xda-6、lsa-21树脂中的任意一种，也可以是其他脱色、脱蛋白树脂等，并不仅限于上述所列举的树脂，其他未列举的树脂同样适用。
42.根据本发明的大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(ii)中，除杂方式还可以为膜过滤，其中膜过滤采用的膜为微滤膜。
43.根据本发明的大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(ii)中，盐溶液为0.1-0.5m nacl溶液，其中，nacl溶液浓度可以是0.1m、0.15m、0.2m、0.25m、0.3m、0.35m、0.4m、0.45m、0.5m，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
44.根据本发明的大麻多糖的制备方法，其中，在步骤(ii)中，所述干燥为冷冻干燥或真空脉动干燥。
45.本发明目的之三是提供硫酸化大麻多糖在制备化妆品中的用途。
46.根据本发明的硫酸化大麻多糖在制备化妆品中的应用，所述应用尤其是在抗氧化、美白、淡斑化妆品中的应用，在所述化妆品中，硫酸化大麻多糖的使用量为按质量计0.1％～99％，其中，使用量可以是按质量计0.1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
47.根据本发明的硫酸化大麻多糖在制备化妆品中的应用，所述化妆品中还包含任选的化妆品领域可接受的载体，载体可以是甘油、维他命b5、维他命e、乳酸、矿脂、海藻提取
物、丙二醇、聚乙二醇、透明质酸(玻尿酸)、荷荷巴油、氨基酸、水解胶原蛋白、卵磷脂、神经酰胺、胆固醇、硬脂酸酯、豆蔻酸酯、棕榈酸酯、甘油酸酯、山梨醇、尿素、羟基酸和糖类、不饱和亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、各种维生素、各种植物油脂、甲壳素、芦荟、海藻、鳄梨油、果酸、曲酸、乳酸、熊果苷、甘草、桑树提取物、氨基酸多肽、水杨酸、凝血酸、樱桃、柠檬、各种植物提取物、各种防腐剂等，但并不仅限于所列举的载体。
48.本发明目的之四是提供硫酸化大麻多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
49.根据本发明的硫酸化大麻多糖在制备抗肿瘤药物中的应用，在所述药物中，硫酸化大麻多糖的使用量为按质量计0.1％～99％，其中，使用量可以是按质量计0.1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
50.根据本发明的硫酸化大麻多糖在制备抗肿瘤药物中的应用，所述药物还包含任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂等，包括但不限于润滑剂、着色剂、润湿剂、填料、分解质和香料，载体可以是聚维酮、硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、二氧化钛、丁羟基茴香醚、滑石粉、微粉硅胶、糊精、淀粉、乳糖等，但并不仅限于所列举的载体。
51.本发明目的之五是提供一种含有硫酸化大麻多糖的抗氧化剂。
52.根据本发明的含有硫酸化大麻多糖的抗氧化剂，在所述抗氧化剂中，硫酸化大麻多糖的使用量为按质量计0.1％～99％，其中，使用量可以是按质量计0.1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
53.根据本发明的含有硫酸化大麻多糖的抗氧化剂，所述抗氧化剂还包含任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂等，包括但不限于润滑剂、着色剂、润湿剂、填料、分解质和香料，载体可以是聚维酮、硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、二氧化钛、丁羟基茴香醚、滑石粉、微粉硅胶、糊精、淀粉、乳糖等，但并不仅限于所列举的载体。
54.本发明中，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的辅料，其本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后或给予保健品后没有潜在毒性。
55.有益效果
56.本发明从大麻花叶或大麻花叶提取cbd之后的残渣中制备得到了大麻多糖，并对其衍生化修饰得到一种硫酸化大麻多糖。所得硫酸化大麻多糖具有较强的抗氧化活性以及抗肿瘤活性。大麻多糖及其衍生化产物硫酸化大麻多糖都具有用作化妆品添加剂提高化妆品抗氧化、美白、淡斑效果的应用前景以及制备抗肿瘤药物的应用前景。
附图说明
57.图1为本发明制备的大麻多糖及硫酸化大麻多糖的红外光谱图。
58.图2示出取代度测定中硫酸根溶液标准曲线。
59.图3示出本发明制备的硫酸化大麻多糖的取代度。
60.图4为本发明制备的硫酸化大麻多糖的dpph自由基清除曲线。
61.图5示出本发明的硫酸化大麻多糖抑制肝癌细胞(hepg2)的细胞活性。
具体实施方式
62.以下实施例仅是对本发明予以解释说明，并未对本发明的保护范围进行任何限制。对于本领域技术人员而言，凡未脱离本发明技术精神所作的同等实施方式或变更均在本发明的保护范围之内。
63.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
64.本发明的红外测试的仪器信息和测试条件如下：
65.thermofisher nicolet is50 ft-ir分光光度计,4000cm-1
～400cm-1
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66.以下实施例中使用的主要材料信息如下：
67.表1
68.材料名称来源规格大麻花叶云南汉盟制药股份有限公司50kg氯磺酸百灵威500ml
69.实施例1硫酸化大麻多糖的制备
70.大麻花叶原料1000g加水提取，大麻花叶原料与水的质量比为1:5，提取2h，过滤，清液真空减压浓缩至固形物含量为10％，得到粗大麻多糖溶液。
71.粗大麻多糖溶液加90％乙醇沉淀，粗大麻多糖溶液与乙醇的体积比为1:4，沉淀过夜，固液分离收集多糖沉淀，多糖沉淀加水溶解，lsa-21树脂通过脱色脱蛋白，洗脱液上deae纤维素柱，用0.15m nacl溶液洗脱，洗脱液脱盐，冷冻干燥，得精制大麻多糖。
72.取大麻多糖分散至甲酰胺溶剂中，大麻多糖与甲酰胺的质量体积比为1:20，于60℃搅拌40min，得到a溶液。
73.氯磺酸于冰水浴中缓慢加入到dmf中，氯磺酸与dmf的体积比为1:3，搅拌30min，混合均匀，得b溶液。
74.将a溶液与b溶液混合进行反应，a溶液中大麻多糖与b溶液中氯磺酸的质量体积比1：2，反应过程采用超声强化以达到促进硫酸化合成的目的，超声波作用于溶液体系的超声功率为5w/l溶液体系，超声为分散式，反应温度50℃，反应时间3h，得c溶液。
75.反应结束后，c溶液降至室温，缓慢加入4倍体积预冷的4℃无水乙醇沉淀，沉淀过夜，离心去清液，沉淀溶于水，用饱和naoh水溶液调ph至7，透析，透析膜分子量为500da，截留液醇沉至乙醇浓度为80％，离心，沉淀冷冻干燥，得硫酸化大麻多糖65g。
76.实施例2硫酸化大麻多糖的制备
77.大麻花叶采用95％乙醇提取cbd之后的残渣，干燥后取1000g，加水提取，残渣与水的质量比1:30，加入纤维素酶、果胶酶混合酶提取，过滤，清液浓缩至固形物含量为20％，得到粗大麻多糖溶液。
78.粗大麻多糖溶液加85％乙醇沉淀，粗大麻多糖溶液与乙醇的体积比为1:6，固液分离收集沉淀，沉淀加水溶解，过hpd-600大孔树脂除杂，洗脱液上deae纤维素柱，用0.45m nacl溶液洗脱，洗脱液脱盐，真空脉动干燥，得精制大麻多糖。
79.取大麻多糖分散至吡啶溶剂中，大麻多糖与吡啶的质量体积比为1:50，30℃条件下搅拌50min，得到a溶液。
80.氯磺酸于冰水浴中缓慢加入到dmf中，氯磺酸与dmf的体积比为1:8，搅拌30min，混
合均匀，得b溶液。
81.将a溶液与b溶液混合进行反应，a溶液中大麻多糖与b溶液中氯磺酸的质量体积比1：2，反应过程采用超声强化以达到促进硫酸化合成的目的，超声波作用于溶液体系的超声功率为3w/l溶液体系，超声为聚能式，反应温度40℃，反应时间6.5h，得c溶液。
82.反应结束后，c溶液降至室温，缓慢加入6倍体积预冷的4℃无水乙醇沉淀，离心去清液，沉淀溶于水，ph调至中性，透析，透析膜分子量为300da，截留液醇沉至乙醇浓度为80％，离心，沉淀真空脉动干燥，得硫酸化大麻多糖88g。
83.实施例3硫酸化大麻多糖的制备
84.脱脂后(即脱去脂肪质)大麻花叶原料1000g加水提取，大麻花叶原料与水的质量比为1:12，加入纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶混合酶提取，过滤，清液膜浓缩至固形物含量为30％，得到粗大麻多糖溶液。
85.粗大麻多糖溶液加80％乙醇沉淀，粗大麻多糖溶液与乙醇的体积比为1:5.5，固液分离收集沉淀，沉淀加水溶解，过微滤膜除杂，洗脱液上deae纤维素柱，用0.5m nacl溶液洗脱，洗脱液脱盐，冷冻干燥或真空脉动干燥，得精制大麻多糖。
86.取大麻多糖分散至丙酰胺溶剂中，大麻多糖与丙酰胺的质量体积比为1:40，搅拌均匀，搅拌温度70℃，搅拌时间35min，得到a溶液。
87.氯磺酸于冰水浴中缓慢加入到dmf中，氯磺酸与dmf的体积比为1:8，搅拌30min，混合均匀，得b溶液。
88.将a溶液与b溶液混合进行反应，a溶液中大麻多糖与b溶液中氯磺酸的质量体积比1:6，反应过程采用分散式超声强化以达到促进硫酸化合成的目的，超声波作用于溶液体系的超声功率是每升溶液接受10w功率超声波刺激强化，反应温度80℃，反应时间2h，得c溶液。
89.反应结束后，c溶液降至室温，缓慢加入5倍体积预冷的4℃无水乙醇沉淀，离心去清液，沉淀溶于水，用饱和naoh水溶液调ph至7，透析，透析膜分子量为500da，截留液醇沉至乙醇浓度为90％，离心，沉淀冷冻干燥，得硫酸化大麻多糖81g。
90.实施例4硫酸化大麻多糖的制备
91.大麻花叶提取cbd之后的干燥残渣1000g，加水提取，残渣与水的质量比为1:20，超声提取2h，过滤，清液浓缩至固形物含量为15％，得到粗大麻多糖溶液。
92.粗大麻多糖溶液加80％乙醇沉淀，粗大麻多糖溶液与乙醇的体积比为1:4，固液分离收集沉淀，沉淀加水溶解，d113大孔树脂除杂，洗脱液上deae纤维素柱，用0.1mnacl洗脱，洗脱液膜过滤脱盐，冷冻干燥或真空脉动干燥，得精制大麻多糖。
93.取大麻多糖分散至乙酰胺溶剂中，大麻多糖与乙酰胺的质量体积比为1:45，于70℃搅拌30min，得到a溶液。
94.氯磺酸于冰水浴中缓慢加入到dmf中，氯磺酸与dmf的体积比为1:5，搅拌30min，混合均匀，得b溶液。
95.将a溶液与b溶液混合进行反应，a溶液中大麻多糖与b溶液中氯磺酸的质量比为1:1，反应过程采用超声强化以达到促进硫酸化合成的目的，超声波作用于溶液体系的超声功率为6w/l溶液体系，超声为分散式，反应温度70℃，反应时间6h，得c溶液。
96.反应结束后，c溶液降至室温，缓慢加入4倍体积预冷4℃的无水乙醇，沉淀，离心去
清液，沉淀溶于水，用饱和naoh水溶液调ph至7，透析，透析膜分子量为400da，截留液醇沉至乙醇浓度为90％，离心，沉淀冷冻干燥，得硫酸化大麻多糖76g。
97.实施例5硫酸化大麻多糖的制备
98.大麻花叶采用95％乙醇提取cbd之后的残渣，干燥，取1000g加15倍质量的水，加入果胶酶提取，常温提取1h，加热至85℃继续提取1h，过滤，清液膜浓缩至固形物含量为25％，得到粗大麻多糖溶液。
99.粗大麻多糖溶液加5倍体积的无水乙醇沉淀，固液分离收集沉淀，沉淀加水溶解，hpd-600大孔树脂除杂，洗脱液上deae纤维素柱，用0.25m nacl盐溶液洗脱，洗脱液脱盐，真空脉动干燥，得精制大麻多糖。
100.取大麻多糖分散至甲基吡啶溶剂中，大麻多糖与甲基吡啶的质量体积比为1:20，搅拌均匀，搅拌温度60℃，搅拌时间40min，得到a溶液。
101.氯磺酸于冰水浴中缓慢加入到dmf中，氯磺酸与dmf的体积比为1:7，搅拌30min，混合均匀，得b溶液。
102.将a溶液与b溶液混合进行反应，a溶液中大麻多糖与b溶液中氯磺酸的质量体积比为1:4，反应过程采用聚能式超声强化以达到促进硫酸化合成的目的，超声波作用于溶液体系的超声功率可以是每升溶液接受2w功率超声波刺激强化，反应温度60℃，反应时间5h，得c溶液。
103.反应结束后，c溶液降至室温，缓慢加入6倍体积预冷至0℃的无水乙醇，沉淀，离心去清液，沉淀溶于水，用饱和naoh水溶液调ph至7，透析，透析膜分子量为500da，截留液醇沉至乙醇浓度为85％，离心，沉淀冷冻干燥，得硫酸化大麻多糖88g。
104.实施例6硫酸化大麻多糖的制备
105.大麻花叶原料干燥、脱脂，取1000g加20倍质量的水提取，加入纤维素酶、淀粉酶提取，过滤，清液浓缩至固形物含量为15％，得到粗大麻多糖溶液。
106.粗大麻多糖溶液加5倍体积的无水乙醇沉淀，固液分离收集沉淀，沉淀加水溶解，ab-8大孔树脂除杂，洗脱液上deae纤维素柱，用0.25m nacl盐溶液洗脱，洗脱液脱盐，冷冻干燥，得精制大麻多糖。
107.取大麻多糖分散至乙基吡啶溶剂中，大麻多糖与乙基吡啶的质量体积比是1:40，搅拌均匀，搅拌温度65℃，搅拌时间50min，得到a溶液。
108.氯磺酸于冰水浴中缓慢加入到dmf中，氯磺酸与dmf的体积比1:8，搅拌30min，混合均匀，得b溶液。
109.将a溶液与b溶液混合进行反应，a溶液中大麻多糖与b溶液中氯磺酸的质量比为1:5，反应过程采用分散式超声强化以达到促进硫酸化合成的目的，超声波作用于溶液体系的超声功率每升溶液接受8w功率超声波刺激强化，反应温度50℃，反应时间4.5h，得c溶液。
110.反应结束后，c溶液降至室温，缓慢加入6倍体积预冷的4℃无水乙醇，沉淀，离心去清液，沉淀溶于水，ph调至中性，透析，透析膜分子量为500da，截留液醇沉至乙醇浓度为90％，离心，沉淀冷冻干燥，得硫酸化大麻多糖79g。
111.实施例7硫酸化大麻多糖的制备
112.大麻花叶提取cbd之后的残渣，取干燥粉末1000g加25倍质量的水提取，过滤，清液浓缩至固形物含量为10％，得到粗大麻多糖溶液。
113.粗大麻多糖溶液加4倍体积的无水乙醇沉淀，固液分离收集沉淀，沉淀加水溶解，除杂，沉淀加水溶解，微滤膜除杂，洗脱液上deae纤维素柱，用0.45mnacl盐溶液洗脱，洗脱液脱盐，真空脉动干燥，得精制大麻多糖。
114.大麻多糖分散至丙基吡啶溶剂中，大麻多糖与丙基吡啶的质量体积比为1:35，搅拌均匀，搅拌温度40℃，搅拌时间35min，得到a溶液。
115.氯磺酸于冰水浴中缓慢加入到dmf中，氯磺酸与dmf的体积比为1:6，搅拌30min，混合均匀，得b溶液。
116.将a溶液与b溶液混合进行反应，a溶液中大麻多糖与b溶液中氯磺酸的质量比为1:3.5，反应过程采用超声强化以达到促进硫酸化合成的目的，超声波作用于溶液体系的超声功率为5w/l溶液体系，超声为聚能式，反应温度65℃，反应时间4h，得c溶液。
117.反应结束后，c溶液降至室温，缓慢加入6倍体积的预冷4℃的无水乙醇沉淀，离心去清液，沉淀溶于水，用饱和naoh水溶液调ph至7，透析，透析膜分子量为300da，截留液醇沉至乙醇浓度为85％，离心，沉淀冷冻干燥，得硫酸化大麻多糖86g。
118.实施例8硫酸化大麻多糖的制备
119.大麻花叶提取cbd之后的残渣1000g，加18倍质量的水超声提取，过滤，清液膜浓缩至固形物含量为25％，得到粗大麻多糖溶液。
120.粗大麻多糖溶液加6倍体积的80％乙醇沉淀，固液分离收集沉淀，沉淀加水溶解，过hz-835大孔树脂除杂，洗脱液上deae纤维素柱，用0.4m nacl盐溶液洗脱，洗脱液脱盐，真空脉动干燥，得精制大麻多糖。
121.取大麻多糖分散至甲酰胺溶剂中，大麻多糖与甲酰胺的质量体积比为1:20，搅拌均匀，搅拌温度50℃，搅拌时间40min，得到a溶液。
122.氯磺酸于冰水浴中缓慢加入到dmf中，氯磺酸与dmf的体积比为1:6.5，搅拌40min，混合均匀，得b溶液。
123.将a溶液与b溶液混合进行反应，a溶液中大麻多糖与b溶液中氯磺酸的质量比为1:6，反应过程采用超声强化以达到促进硫酸化合成的目的，超声波作用于溶液体系的超声功率为6w/l溶液体系，超声为分散式，反应温度80℃，反应时间2h，得c溶液。
124.反应结束后，c溶液降至室温，缓慢加入4倍体积预冷4℃的无水乙醇沉淀，离心去清液，沉淀溶于水，用饱和naoh水溶液调ph至中性，透析，透析膜分子量为500da，截留液醇沉至乙醇浓度为80％，离心，沉淀冷冻干燥，得硫酸化大麻多糖86g。
125.实施例9硫酸化大麻多糖的制备
126.大麻花叶提取cbd之后的残渣，干燥，取1000g，加15倍质量的水加热90℃提取2h，过滤，清液浓缩至固形物含量为30％，得到粗大麻多糖溶液。
127.粗大麻多糖溶液加90％乙醇沉淀，粗大麻多糖溶液与乙醇的体积比为1:5.5，固液分离收集沉淀，沉淀加水溶解，过d301大孔树脂除杂，洗脱液上deae纤维素柱，用0.35m nacl盐溶液洗脱，洗脱液脱盐，冷冻干燥或真空脉动干燥，得精制大麻多糖。
128.取大麻多糖分散至吡啶溶剂中，大麻多糖与吡啶的质量体积比为1:35，搅拌均匀，搅拌温度45℃，搅拌时间50min，得到a溶液。
129.氯磺酸于冰水浴中缓慢加入到dmf中，氯磺酸与dmf的体积比为1:5，搅拌30min，混合均匀，得b溶液。
130.将a溶液与b溶液混合进行反应，a溶液中大麻多糖与b溶液中氯磺酸的质量比为1:4，反应过程采用超声强化以达到促进硫酸化合成的目的，超声波作用于溶液体系的超声功率为5w/l溶液体系，超声为分散式，反应温度50℃，反应5h得c溶液。
131.反应结束后，c溶液降至室温，缓慢加入4倍体积预冷的4℃无水乙醇沉淀，离心去清液，沉淀溶于水，用饱和naoh水溶液调至中性，透析，透析膜分子量为500da，截留液加乙醇沉至乙醇浓度为90％，离心，沉淀冷冻干燥，得硫酸化大麻多糖91g。
132.实施例10含硫酸化大麻多糖的精华液的制备
133.本实施例为利用本发明实施例1制备的硫酸化大麻多糖混匀后用来制备具有美白、淡斑、去痤抗氧化作用的精华液，经过下列各步骤：
134.按下列质量百分比的原料备料：
[0135][0136]
(1)将b组原料混合充分，50℃水浴3min至充分溶胀，搅拌均匀后无明显颗粒物；
[0137]
(2)将a组原料中的甘油和黄原胶混合，分散均匀后加入a组中的去离子水搅拌均匀后，依次加入a组中硫酸化大麻多糖以及其他原料，于80℃水浴、30r/s的转速搅拌混匀，直至所有原料充分溶解；
[0138]
(3)将步骤(1)混合物加入步骤(2)的混合中，于80℃水浴、50r/s的转速搅拌直至混合均匀，无明显颗粒物；
[0139]
(4)将步骤(3)混合物于25℃水浴，50r/s的转速搅拌降温至40℃，加入c组原料，匀速搅拌均匀；
[0140]
(5)50r/s的转速搅拌降温至室温，得到含硫酸化大麻多糖的精华液。
[0141]
其它实施例制备的硫酸化大麻多糖以与实施例10相同的工艺制备获得含硫酸化大麻多糖的精华液。
[0142]
实施例11含硫酸化大麻多糖的护肤霜的制备
[0143]
本实施例为利用本发明实施例2制备的硫酸化大麻多糖来制备具有美白、淡斑、去痤抗氧化作用的护肤霜，经过下列各步骤：
[0144]
按下列质量百分比的原料备料：
[0145][0146]
(1)将c组原料混合充分，室温静置1小时至充分溶胀，搅拌均匀后无明显颗粒物；
[0147]
(2)将a组原料中的甘油和黄原胶混合，分散均匀后加入a组中的去离子水搅拌均匀后，依次加入a组中硫酸化大麻多糖以及其他原料，于80℃水浴、30r/s的转速搅拌混匀，直至所有原料充分溶解；
[0148]
(3)将b组原料中的氢化卵磷脂和辛酸/癸酸甘油三酯分散均匀，于80℃水浴加热，搅拌至充分溶解后，依次加入b组中其他原料，80℃水浴加热，搅拌至充分溶解；
[0149]
(4)将步骤(3)混合好的b组物料，少量多次加入步骤(2)混合好的a组物料中，保持80℃水浴，3000r/s高速均质3min；
[0150]
(5)将步骤(1)溶胀好的c组原料分3次加入到步骤(4)的混合物中，保持80℃水浴，3000r/s高速均质3min至无明显颗粒物；
[0151]
(6)将混合好的d组物料加入步骤(5)的混合物中，保持80℃水浴，3000r/s高速均质3min至无明显颗粒物；
[0152]
(7)将步骤(6)混合物于25℃水浴，50r/s的转速搅拌降温至40℃加入e组原料匀速搅拌均匀；
[0153]
(8)50r/s的转速搅拌降温至室温，得到含硫酸化大麻多糖的护肤霜。
[0154]
其它实施例制备的硫酸化大麻多糖以与实施例11相同的工艺制备获得含硫酸化大麻多糖的护肤霜。
[0155]
实施例12含硫酸化大麻多糖的乳液的制备
[0156]
本实施例为利用本发明实施例9制备的硫酸化大麻多糖制备具有美白、淡斑、去痤抗氧化作用的乳液，经过下列各步骤：
[0157]
按下列质量百分比的原料备料：
[0158][0159][0160]
(1)将c组原料混合充分，室温静置1小时至充分溶胀，搅拌均匀后无明显颗粒物；
[0161]
(2)将a组原料中的丁二醇和黄原胶混合，分散均匀后加入a组中的去离子水搅拌均匀后，依次加入a组中硫酸化大麻多糖以及其他原料，于80℃水浴、30r/s的转速搅拌混匀，直至所有原料充分溶解；
[0162]
(3)将b组原料中的氢化卵磷脂和辛酸/癸酸甘油三酯分散均匀，于80℃水浴加热，搅拌至充分溶解后，依次加入b组中其他原料，80℃水浴加热，搅拌至充分溶解；
[0163]
(4)将步骤(3)混合好的b组物料，少量多次加入步骤(2)混合好的a组物料中，保持80℃水浴，3000r/s高速均质3min；
[0164]
(5)将步骤(1)溶胀好的c组原料分3次加入到步骤(4)的混合物中，保持80℃水浴，3000r/s高速均质3min至无明显颗粒物；
[0165]
(6)将混合好的d组物料加入步骤(5)的混合物中，保持80℃水浴，3000r/s高速均质3min至无明显颗粒物；
[0166]
(7)将步骤(6)混合物于25℃水浴，50r/s的转速搅拌降温至40℃加入e组原料匀速
搅拌均匀；
[0167]
(8)50r/s的转速搅拌降温至室温，得到含硫酸化大麻多糖的乳液。
[0168]
其它实施例制备的硫酸化大麻多糖以与实施例12相同的工艺制备获得含硫酸化大麻多糖的乳液。
[0169]
测试例硫酸化大麻多糖结构表征及活性测定
[0170]
(1)结构鉴定(红外分析)
[0171]
样品受到频率连续变化的红外光照射时，分子吸收其中一些频率的辐射，使得从基态跃迁到激发态，相应于这些区域的投射光强减弱，不同的基团或者原子受红外的激发，会有不同，借此观察样品中特征化学键的移动或者出现消失等情况。本测试中所用样品为样品a、样品b、样品c和样品d，其中样品a为实施例1制得的硫酸化大麻多糖(反应时间为3小时的产物)，样品b为实施例1制得的硫酸化大麻多糖(反应时间为2.5小时的产物)，样品c为实施例1制得的硫酸化大麻多糖(反应时间为2小时的产物)，样品d为实施例1制得的大麻多糖(精制大麻多糖)，测试步骤如下：
[0172]
样品和溴化钾24h烘干，取出后放干燥器冷却，防止吸水；称取1-2mg样品，加入100-200倍质量的溴化钾，用玛瑙研钵研磨至无颗粒感；将研磨好的样品放入压片机内，铺上薄薄的一层即可，得到透明压片；检测：先测试空气作为空白，再进行样品的红外检测。红外检测结果如图1所示。从图1中可以看出，波长3500cm-1
左右为典型的羟基峰，波长1250cm-1
左右为典型的硫酸根的峰，从而证实了大麻多糖硫酸化成功。
[0173]
(2)取代度测定
[0174]
采用bacl
2-明胶浊度法测定硫酸化大麻多糖取代度。
[0175]
原理：采用bacl
2-明胶浊度法，通过酸水解从糖复合物中释放硫酸基，生成硫酸钡，用分光光度法测定。
[0176]
步骤：吸取一系列1mg/ml硫酸根标准液(0.5、0.625、0.75、0.875、1、1.125、1.25、1.375ml)于试管
→
纯水补至4ml
→
0.18mol/l盐酸4ml
→
明胶溶液0.4ml，振摇10s
→
迅速加入氯化钡-明胶溶液1.6ml，振摇2min，放置20min
→
波长360nm测定吸光值。同时，作空白试验(用1.6ml的明胶溶液代替氯化钡-明胶溶液)。硫酸根标准曲线如图2所示。经计算，实施例1-9制备所得硫酸化大麻多糖取代度如图3所示。
[0177]
(3)对dpph自由基的清除作用
[0178]
dpph法广泛用于定量测定生物试样、酚类物质和食品的抗氧化能力。二苯代苦味酰基自由基(dpph
·
)是一种很稳定的以氮为中心的自由基，其稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。测试样品清除这种自由基，表示样品具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基等自由基的有效浓度，并且打断脂质过氧化链反应的作用。dpph
·
有个单电子，光谱扫描显示反应体系在517nm处有强吸收，加入受试样品后，通过在517nm，测定吸光度减少的情况可以反映受试物的抗氧化活性，计算其清除自由基的能力。本测试中所用五个样品分别为vc、实施例1制得的大麻多糖(精制大麻多糖，hp)，以及实施例1、8和9制得的硫酸化大麻多糖(hps-1、hps-8和hps-9)，测试中步骤如下：
[0179]
1、配制dpph的甲醇溶液(其中dpph为0.2mmol，dpph的甲醇溶液浓度为7.9mg/100ml)，现配现用。
[0180]
2、配制样品溶液：加入2ml dpph的甲醇溶液，2ml甲醇，1ml样品(vc、hp、hps-1、hps-8和hps-9，各样品浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3mg/ml)。
[0181]
3、配制空白溶液：加入2ml dpph的甲醇溶液，2ml甲醇，1ml蒸馏水。
[0182]
4、样品本底值(ab)：加入2ml甲醇，2ml蒸馏水，1ml样品(vc、hp、hps-1、hps-8和hps-9，各样品浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3mg/ml)。
[0183]
5、将2、3、4，震荡后在黑暗中静置30min。
[0184]
6、517nm处测定od。
[0185]
按下式计算清除率：
[0186][0187]
其中：a0为用水代替样品时测得的吸光值；ai为样品不同浓度下测得的吸光值；aj为本底吸光值。
[0188]
图4的清除dpph自由基活性结果表明，本发明的硫酸化大麻多糖的生物活性均高于未硫酸化的大麻多糖。
[0189]
(4)硫酸化大麻多糖抑制肝癌细胞(hepg2)细胞活性研究
[0190]
本测试中样品组的样品分别为实施例1(hps-1)、实施例8(hps-8)、实施例9(hps-9)，以及大麻多糖(hp)，以不同质量浓度20、50、100、200、500、1000μg/ml的10μl样品水溶液处理肝癌细胞(hepg2)，考察硫酸化大麻多糖的抗肿瘤活性。对照组为将10μl上述不同质量浓度的样品水溶液替换为10μl水。
[0191]
取90μl细胞液于96孔板中，细胞密度约为1
×
105个/ml，置于37℃、5％co2培养箱培养4h后，加入10μl不同质量浓度的样品，继续培养24h，加入20μl 5mg/ml的mtt试剂培养4h，移去上清液，加入200μl dmso，振荡10min后用酶标仪在570nm下测定吸光度值。多糖对肝癌细胞的抑制率的计算公式为：
[0192]
抑制率＝[(abs0-abs1)/abs0]
×
100％，
[0193]
其中，abs1、abs0分别为样品组和对照组的吸光度值。
[0194]
图5结果表明，硫酸化大麻多糖抑制肝癌细胞(hepg2)细胞活性均高于未硫酸化的大麻多糖。