缓解土壤酸化的微生物的筛选方法、多噬伯克霍尔德氏菌及其应用与流程

1.本发明属于农业微生物学技术及生物防治领域，特别是缓解土壤酸化的微生物的筛选方法、多噬伯克霍尔德氏菌及其应用。


背景技术：

2.我国烟草的种植范围很广泛，土壤的ph值对烟草的生长影响很大，烟草在ph值为 4.5-8.5的土壤上可以生长，但是优质烟草的种植ph值在6.5-7.5之间，其烟碱适中，化学成分协调，烟叶品质高，过高或过低的ph值都不利于烟叶的质量。烟草的长期种植会不断酸化土壤，持续对土壤产生负面影响，降低土壤的酸化缓冲能力，造成土壤易板结和土壤通透性变差。土壤的这种变化还会反过来影响烟草的种植，造成烟草产量与品质共同下降。
3.土壤酸化作为土壤退化的一种表现，不适合烟草生长。土壤的ph值和酚酸的浓度呈负相关，土壤酸化会导致酚酸的积累，从而改变细菌群落结构和多样性，最终影响烟草生长。土壤中过多h+的累积会抑制植物根系的生长。经分析其原因，可能是低ph值引起 al
3+
的活跃，铝离子会毒害烟株根系，造成烟株对水分和营养物质吸收的减少。近10年来湖北烟区优质核心烟区土壤退化明显加快，部分地区酸化严重；2012年湖北省烟区土壤的 ph值变幅为4.1-8.2，平均ph为6.2，属弱酸性土壤。湖北省烟区有30.3％的土地土壤的 ph值(5.5-6.5)十分适合烟草生长，适宜ph值(5-5.5、6.5-7.5)的土壤比例占植烟土壤的47.9％；其中恩施烟区植烟土壤酸性土样占70％以上。
4.烟草的连作障碍是烟草不适宜连续种植的重要原因。主要单一作物连作导致根系分泌物在土壤中不断积累，从而对作物和土壤微生物产生化感作用。烟草在生长过程中，主要的根系分泌物为苯甲酸与3-苯丙酸。烟草根系分泌物会抑制烟草幼苗的生长发育及其生理代谢过程。因此使用生物改良土壤酸化和降解烟草根系分泌物的菌种筛选的理论研究和开发价值越来越收到重视。


技术实现要素：

5.针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种缓解土壤酸化的微生物的筛选方法、多噬伯克霍尔德氏菌及其应用，具体通过以下技术实现。
6.缓解土壤酸化的微生物的筛选方法，包括以下步骤：
7.s1、取土样加水振荡(例如加无菌水用涡旋振荡器进行振荡)20min，制成质量分数为10％的混合液；
8.s2、稀释涂布于苯甲酸无机盐培养基上，25-30℃恒温培养，直至有菌落出现；
9.所述苯甲酸无机盐培养基的原料中含有：(nh4)2so
4 2g，na2hpo
4 1.3g，kh2po
4 2g， nacl 5g，苯甲酸含量为1g/l，去离子水；
10.s3、挑取单菌落划线保藏接种于苯甲酸无机盐培养基中，37℃、180r/min振荡培养24h，将菌液与50％甘油水溶液以1:1的比例混合，得待鉴定菌株菌液并于-20℃保藏；
11.s4、将待鉴定菌株菌液进行隔夜活化，提取待鉴定菌株菌液中细菌的基因组dna为模板，pcr扩增16s rdna基因片段，纯化后测序，进行序列blast比对，选取同源性较高的16s rdna基因序列作为参比对象，构建待筛选微生物的系统发育树，结合菌落图进行待筛选微生物的菌株鉴定，筛选得到缓解土壤酸化的微生物菌株。
12.blast(basic local alignment search tool)比对是一种常用的生物大分子序列比对搜索工具，是生物信息学常用的工具软件，可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系(源于百度百科内容)。mega6.0软件和neighbour-joining法也是一种常见的系统发育树的绘制软件和方法。通过采用上述方法，能够筛选出具有缓解烟草种植土壤酸化，缓解因苯甲酸诱导导致的烟草连作障碍的的微生物菌株。
13.优选地，上述筛选方法中，步骤s4具体为：以1％的接种量，将待鉴定菌株菌液接种于苯甲酸无机盐培养基中，25-30℃、180r/min过夜活化培养(12h)；取培养液1ml， 12000g/min离心5min，弃上清液收集细胞；
14.加入500μl超纯水重悬细胞，煮沸10min后，12000g/min离心5min，取上清液作为模板，以16s通用引物进行pcr扩增，16s通用引物为：
15.正向引物16sf：aaggaggtgatccagccgca；
16.反向引物16sr：agagtttgatcctggctcag；
17.pcr反应体系为：超纯水6μl，2
×
easy taq pcr super mix 10μl，正、反向引物及模板各1μl；
18.反应程序为：94℃3min，94℃45s，57℃45s，72℃45s，共30个循环；最后72℃ 10min；
19.将16s rdna扩增产物纯化回收后测序，测序结果在genebank数据库进行blast比对，选取同源性较高的16s rdna基因序列作为参比对象，运用mega6.0软件和neighbour-joining法构建系统发育树；结合形态特征进行待筛选微生物的菌株鉴定，筛选得到缓解土壤酸化的微生物菌株。
20.申请人通过采用上述筛选方法，从烟株种植土壤中偶然筛选得到了一种能够缓解土壤酸化，缓解因苯甲酸诱导导致的烟草连作障碍的微生物，即多噬伯克霍尔德氏菌 (burkholderia multivorans)bjs-3，采用权利要求1所述的筛选方法筛选获得，并于2021 年08月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为 cctcc no.m2021981。申请人通过对这种多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3进行一系列的试验验证，发现多噬伯克霍尔德氏菌的这种菌株bjs-3能够有效降解土壤中的苯甲酸，提升烟株种植土壤的ph值，对烟草连作障碍具有很好的缓解效果。
21.多噬伯克霍尔德氏菌(burkholderia multivorans)bjs-3在缓解土壤酸化上的应用。
22.优选地，在缓解土壤酸化上的具体应用方法为：
23.p1、将多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌株接种在lb培养基中，180r/min、37℃隔夜活化(12h)；以1％的接种量接入lb培养基中，180r/min、37℃培养48h，得菌液；
24.p2、将步骤p1的菌液稀释5倍制成菌液稀释液，按200l/亩的用量均匀施加在酸化土壤上，保持土壤湿润(相对湿度为55-65％)；
25.p3、每隔21天按照步骤p2的方式重复施加菌液稀释液；定期检测土壤ph值，直至土壤ph值达到烟株生长要求。
26.优选地，上述应用方法的步骤p2中，将菌液稀释液施加在酸化土壤的具体方式为：取菌液稀释液按200-300ml/株的用量灌根施加在烟株周围的土壤上；在第21天补加相同量的菌液稀释液。
27.优选地，上述应用方法的步骤p3中，检测土壤ph值的方法为每隔7天对土壤取样进行土壤ph值检测。
28.与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供了一种缓解土壤酸化的微生物的筛选方法，并根据该筛选方法得到了一种多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3，将这种多噬伯克霍尔德氏菌的菌株制成菌液施加在土壤中，能够显著提升土壤ph值，降解土壤中烟株根部分泌的苯甲酸，缓解土壤酸化，对烟草连作障碍具有很好的缓解效果；对环境安全无公害，具有良好的开发前景和应用潜力。
附图说明
29.图1为实施例1的筛选的微生物(即多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3)的单菌落照片；
30.图2为实施例1的筛选的微生物(即多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3)的16s rdna聚类分析图；
31.图3为实施例2的多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的结晶紫染色后的图片；
32.图4为实施例2的苯甲酸无机盐培养基中苯甲酸变化曲线图；
33.图5为实施例3的多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液和菌体对酸化土壤样品的ph值的变化曲线图；
34.图6为实施例4的多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液对有机酸模拟酸化土壤ph的影响；
35.图7为实施例5的多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液在添加有氮磷钾肥料的烟草盆栽土壤；
36.图8为实施例6的多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液在苯甲酸诱导的烟草连作障碍实验中的叶片数量变化；
37.图9为实施例6的多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液在苯甲酸诱导的烟草连作障碍实验中的烟株高度变化；
38.图10为实施例6的多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液在苯甲酸诱导的烟草连作障碍实验中的最大叶片面积变化。
具体实施方式
39.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
40.实施例1：缓解土壤酸化的细菌的筛选及鉴定
41.s1、随机选取10g种植烟株的田块中的土样，放入90ml去离子水中，置于锥形瓶中振荡20min，制成质量分数为10％的混合液；
42.s2、将s1制得的混合液依次稀释10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
后，取10-5
、 10-6
、10-7
的稀释液分别涂布于苯甲酸无机盐培养基上，置于28℃恒温培养箱中恒温培养，直至菌落产生；
43.所述苯甲酸无机盐培养基的原料为：(nh4)2so
4 2g，na2hpo
4 1.3g，kh2po
4 2g， nacl 5g，苯甲酸含量为1g/l，去离子水；
44.s3、挑取单菌落划线保藏并接入装有苯甲酸无机盐培养基的pa瓶中，置于37℃、 180r/min的摇床中振荡培养24h；然后与50％甘油溶液以1:1的比例混合，并置于冰箱中零下20℃保藏。单菌落照片如图1所示；
45.s4、降解苯甲酸微生物菌株的鉴定
46.将菌株以1％的接种量，分别接种于苯甲酸无机盐培养基中，于28℃、180r/min过夜 (12h)活化培养；取菌液1ml，12000g/min离心5min，弃上清收集细胞；加入500μl超纯水重悬细胞，煮沸10min后，12000g/min离心5min，取上清作为模板，以下列16s通用引物进行pcr扩增：
47.正向引物16sf：aaggaggtgatccagccgca；
48.正向引物16sr：agagtttgatcctggctcag；
49.pcr反应体系为：超纯水6μl，2
×
easy taq pcr super mix 10μl，正、反向引物及模板各1μl；
50.反应程序为：94℃3min，94℃45s，57℃45s，72℃45s，共30个循环；最后72℃ 10min。
51.将16s rdna扩增产物纯化回收后测序，测序结果在genebank数据库进行blast比对，选取同源性较高的16s rdna基因序列作为参比对象，运用mega6.0软件和 neighbour-joining法构建系统发育树；结合形态特征与16s rdna序列分析，如图1、2所示，对菌株进行鉴定，发现菌株bjs-3为多噬伯克霍尔德氏菌(burkholderia multivorans)。
52.实施例2：多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3降解苯甲酸能力的检测
53.1、以1％的接种量，将过夜活化培养的菌株接入装有苯甲酸无机盐培养基的锥形瓶中，置于37℃、180r/min的摇床中振荡培养；振荡培养过程中，每隔12h，取出5ml培养液加入到10ml无菌离心管中，8000g、25℃离心10min后过滤(0.22μm滤膜)，去掉菌体即为待测液；
54.2、如图3所示，选用紫外可见分光光度法，用石英比色皿装待测液在波长230nm下测定其吸光度，根据吸光度和苯甲酸标准曲线计算样品中苯甲酸的残留含量；
55.根据上述测定吸光度值，计算获得培养基样品中，经微生物降解后残留的苯甲酸含量，并计算获得在不同时间点的苯甲酸降解率，如图4所示。从图4中可以明显看到培养基中的苯甲酸含量在短短40min内，从1000ng/l显著下降至不超过50ng/l。
56.实施例3：多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3对酸化的烟株田块的土壤样品的ph值的影响
57.1、土壤处理
58.将酸化的烟株田块的土壤过3.5mm的筛网并混合均匀，分装到若干250ml锥形瓶中，每个锥形瓶中称取150g酸化土壤样品。
59.2、菌液处理
60.将多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌种接种到lb培养基的pa瓶中，置于180r/min、37
℃的摇床里，过夜活化；然后再以1％的接种量接入lb培养基中，在180r/min、37℃的摇床中培养48h。
61.3、菌液与菌体对土壤ph的影响试验
62.(1)多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液对土壤ph的影响
63.将培养48h的菌液以酸化土壤样品质量10％的用量均匀施加在酸化土壤样品中，将锥形瓶瓶口用纸包好，保持土壤的湿度；
64.每隔7天取样检测酸化土壤样品的ph值，具体方法为：称取10g室内自然风干处理后的酸化土壤样品，加至50ml离心管中，再加入去离子水25ml，利用涡旋仪震荡1min；静置2h取上清液，再用ph计检测上清液的ph值，即为酸化土壤样品的ph值。
65.(2)多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌体对土壤ph的影响
66.将培养48h的菌液在8000g下离心10min，去掉上清液，以与上清液相同体积的去离子水重悬，得到菌体悬液；将菌体悬液以酸化土壤样品质量10％的用量均匀施加于酸化土壤样品中，最后将锥形瓶瓶口用纸包好，保持土壤的湿度；
67.每隔7天取样检测酸化土壤样品的ph值，具体方法为：称取10g风干处理后的酸化土壤样品，加至50ml离心管中，再加入去离子水25ml，利用涡旋仪震荡1min；静置2h，再用ph计检测上清液的ph值，即为酸化土壤样品的ph值。
68.如图5所示，图中，曲线“bjs-3broth”即对应的多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液，曲线“bjs-3cell”即对应的多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌体，ck(h2o)和ck(lb)分别为去离子水空白对照和lb培养基阴性对照。从图5可以看出，多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3 配制成菌液后能够显著提升酸化土壤样品的ph值，而选用多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌体，则对酸化土壤样品的ph值几乎没有影响。而施加阴性对照的lb培养基的酸化土壤样品的ph值上升，经分析可能是因为培养基中的养分促进了土壤中固有的细菌生长与代谢，分解了土壤中的有机酸，以及导致碱性离子如nh
4+
的形成，最终促使了土壤ph的增加。
69.实施例4：多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3对有机酸模拟酸化土壤的ph值的影响
70.1、土壤处理：
71.与实施例3的土壤处理方法相同。
72.2、菌液处理
73.多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的处理与实施例3的菌液处理方法相同。
74.3、试验处理
75.向锥形瓶中的酸化土壤样品加入10ml有机酸溶液(苯甲酸45mg、3-苯丙酸45mg、延胡索酸45mg、琥珀酸21mg、溶于250ml的水中、ph值＝3.2)；每隔7天补加一次等量的有机酸溶液，以此模拟烟草在种植时持续向土壤分泌有机酸的过程。
76.先将培养48h的多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3菌液稀释5倍，以酸化土壤样品质量10％的用量均匀施加于酸化土壤样品中，将锥形瓶瓶口用纸包好，保持土壤的湿度。
77.每隔7天取样检测土壤ph值；每隔21天向土壤里补充等量的菌液；称取10g风干后的土壤加至50ml离心管中，再加入去离子水25ml，利用涡旋仪震荡1min；静置2h，再用 ph计检测上清液的ph值，即为酸化土壤样品的ph值。
78.如图6所示，曲线“bjs-3”是施加多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3菌液对应的土壤的ph值变化情况，曲线“ck(h20)”是空白对照。从图6中可以看到，虽然不断在酸化土壤样品中补
充有机酸，但是施加了多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的酸化土壤样品的ph值显著上升；而空白对照的酸化土壤样品的ph值基本保持不变，经分析可能是因为土壤中施加的有机酸成为了土壤中固有微生物的碳源被利用，因而继续施加有机酸并没有导致土壤ph的持续下降。
79.实施例5：多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3对模拟施用氮磷钾肥料的烟草盆栽土壤的ph值的影响
80.1、烟苗和酸化土壤样品处理
81.将酸化土壤样品搅拌均匀，装满若干高10cm，直径12cm的圆形塑料花盆，将有6片真叶的烟草苗移栽到每个塑料花盆中，用去离子水浇透土壤，注意烟草苗移栽的成活情况。
82.2、菌液处理
83.与实施例3的多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液处理方式相同。
84.3、试验处理
85.将移栽成活的烟苗分为6组，每组6个重复；其中每株烟草中添加9.75g烟草专用复合肥(氮磷钾各占肥料的15％，采购自湖北香青化肥有限公司)，用以模拟烟株的实际种植环境。
86.试验组将多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3菌液稀释5倍制成菌液稀释液后，在每株烟草的酸化土壤样品中施加20ml菌液稀释液，在第35天补加等量的菌液稀释液；对照组采用相同方法施加去离子水；每隔7天对花盆中的酸化土壤样品进行取样，每次取样10g，每个花盆中取样重复三次；将每次取样的酸化土壤样品加入25ml的去离子水，在涡旋仪上震荡1min，在静置2h后，使用ph计检测上清液的ph值，即为土壤ph值。
87.如图7所示，曲线“bjs-3”是施加多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3菌液对应的土壤的ph值变化情况，曲线“ck(h2o)”是空白对照。从图7可以看到，在添加了氮磷钾肥料的烟草盆栽土壤中，施加了多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3菌液的土壤样品与对照组的ph值均有所下降，而对照组的酸化土壤样品的ph值下降相对更明显，经分析可能是因为多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3随着时间的延长，在土壤中的数量一般也会呈一定的趋势下降，从而导致其缓解土壤酸化作用的减弱。
88.实施例6：多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液对苯甲酸诱导的烟草连作障碍的缓解测试
89.1、烟苗处理
90.烟苗处理方式与实施例5相同。
91.2、菌液处理
92.将多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液分别接入lb培养基，180r/min、37℃摇床过夜活化；再以1％的接种量接入100ml lb培养基，在180r/min、37℃的摇床中培养48h。
93.3、试验处理
94.取1g/l的苯甲酸溶液每次向烟草盆栽中添加10ml，每隔7天添加一次，用以模拟连作障碍对烟草的影响。试验组为分别向烟苗盆栽中添加多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3菌液 20ml，每隔21天重复施加菌液；对照组包括添加等量清水、添加等量lb培养基和添加等量3-苯甲酸的三个处理组。各试验组和处理组的6株烟草重复。
95.在进行烟草盆栽试验中，通过测量烟草的株高，叶片数和最大叶面积来对烟草的生长情况进行检测。其中烟草的最大叶面积的检测方法：烟草的叶片的形状较为统一，可以
用一种简易的公式计算叶片的面积，即，叶面积＝叶片宽
×
叶片长
×
0.6345，式中的0.6345为烤烟叶片面积的计算系数。
96.如图8-10所示，图中，曲线“ba+bjs-3”是施用多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液的试验组，ck(h2o)、ba、ck(lb)分别是添加去离子水、添加苯甲酸和添加lb培养基的处理组。从图8-10中可以看到，施加多噬伯克霍尔德氏菌bjs-3的菌液的烟株生长状态总体而言更好。