技术特征：
1.金刚烷胺半抗原a或b，其分别具有如结构式(
ⅴ
)或结构(ⅶ)所示的化学结构：2.一种制备权利要求1所述的金刚烷胺半抗原a的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)称取2g-10g 3-氨基金刚烷-1-甲酸和1.92-9.6g boc酸酐加入单口瓶中，加入0.05-0.26g 4-二甲氨基吡啶，用30ml叔丁醇溶解，在70～80℃反应5～8小时；步骤(2)将反应后液体减压旋蒸，除去溶剂叔丁醇，得到大量淡黄色的油状物，即为粗品化合物2；步骤(3)将所述粗品化合物2溶解在乙酸乙酯中，使用0.1m硫酸溶液和纯水洗涤两遍后，收集有机相，减压旋蒸，得到化合物2；步骤(4)将0.5-2g所述化合物2溶解在10ml 80％的甲醇水溶液中，加入0.3-1.3g edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和0.25-1.0g nhs(n-羟基丁二酰亚胺)，20～25℃反应1小时，得到中间体化合物3的溶液；将0.9-3.6gβ-丙氨酸的50％m/v水溶液缓慢滴加至反应液中，继续在20～25℃反应过夜；步骤(5)将所述反应后溶液减压旋蒸除去甲醇和水，再重新加入30ml水和30ml乙酸乙酯，搅拌30分钟后分层，收集有机相，旋蒸后得到粗品化合物4，并将所述粗品化合物4过柱纯化，得到其纯品0.5g；步骤(6)将0.2-1.0g所述纯化的化合物4溶解在1ml甲醇中，加入0.5ml浓盐酸，在20～25℃搅拌3～5小时，用0.5m氢氧化钠溶液调节ph至6，然后减压旋蒸除去溶剂甲醇和水后，得到0.1-0.6g粗品化合物5；以及步骤(7)将所述粗品化合物5重新用甲醇溶解后，过滤除去无机盐，滤液减压旋蒸后得到较为纯净的化合物5，使用柱硅胶继续分离纯化，得到所述金刚烷胺半抗原a；优选地，所述步骤(1)称取5g 3-氨基金刚烷-1-甲酸和4.8g boc酸酐加入单口瓶中，加入0.13g 4-二甲氨基吡啶，用30ml叔丁醇溶解，在70～80℃反应5～8小时；所述步骤(2)将反应后液体减压旋蒸，除去溶剂叔丁醇，得到大量淡黄色的油状物，即为粗品化合物2；所述步骤(3)将所述粗品化合物2溶解在乙酸乙酯中，使用0.1m硫酸溶液和纯水洗涤两遍后，收集有机相，减压旋蒸，得到化合物2；所述步骤(4)将1g所述化合物2溶解在10ml 80％的甲醇水溶液中，加入0.65g edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和0.5g nhs(n-羟基丁二酰亚胺)，20～25℃反应1小时，得到化合物3的溶液；将1.8gβ-丙氨酸的50％m/v水溶液缓慢滴加至反应液中，继
续在20～25℃反应过夜；所述步骤(5)将所述反应后溶液减压旋蒸除去甲醇和水，再重新加入30ml水和30ml乙酸乙酯，搅拌30分钟后分层，收集有机相，旋蒸后得到粗品化合物4，并将所述粗品化合物4过柱纯化，得到其纯品0.5g；所述步骤(6)将0.5g所述粗品化合物4溶解在1ml甲醇中，加入0.5ml浓盐酸，在20～25℃搅拌3～5小时，用0.5m氢氧化钠溶液调节ph至6，然后减压旋蒸除去溶剂甲醇和水后，得到0.6g粗品化合物5；以及所述步骤(7)将所述粗品化合物5重新用甲醇溶解后，过滤除去无机盐，滤液减压旋蒸后得到较为纯净的化合物5，使用柱硅胶继续分离纯化，得到所述金刚烷胺半抗原a。3.一种制备权利要求1所述的金刚烷胺半抗原b的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将1-5g金刚烷胺与0.98-2.94g乙醛酸溶解在20ml二氯甲烷中，在室温搅拌反应24小时；以及步骤(2)将所述反应后液体减压旋蒸，除去二氯甲烷后，得到大量白色固体化合物，加入20ml 2m盐酸溶解后，在100℃回流5～8小时后，减压旋蒸除去水，得到0.5-3.2g所述半抗原b；优选地，所述步骤(1)将2g金刚烷胺与1.96g乙醛酸溶解在20ml二氯甲烷中，在室温搅拌反应24小时；以及所述步骤(2)将所述反应后液体减压旋蒸，除去二氯甲烷后，得到大量白色固体化合物，加入20ml 2m盐酸溶解后，在100℃回流5～8小时后，减压旋蒸除去水，即得到1.6g所述半抗原b。4.一种金刚烷胺抗原a或b的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)所述金刚烷胺半抗原a或者半抗原b 4-16mg溶解在1ml dmf中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)1.5～6.0mg和0.9～3.6mg n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，25℃反应1～2小时,形成溶液1；步骤(2)称取10-30mg bsa、ova、klh、bgg、rsa、psa、lph或has载体蛋白溶解在1ml 0.01m nahco3缓冲液中，形成溶液2；步骤(3)将所述步骤(1)的所述金刚烷胺半抗原a或b的溶液1缓慢滴加入所述步骤(2)的溶液2中，4℃搅拌反应过夜；以及步骤(4)将所述步骤(3)的所述反应液用0.01m pbs溶液在4℃透析3天，每天更换两次透析液；将透析液离心后，取出上清液，即为金刚烷胺抗原a或b；优选地，步骤(1)所述金刚烷胺半抗原a或者半抗原b 4mg溶解在1ml dmf中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)2.9mg和1.8mg n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，25℃反应1～2小时，形成溶液1；步骤(2)称取13.5mg ova溶解在1ml 0.01m nahco3缓冲液中，形成溶液2；步骤(3)将所述步骤(1)的所述金刚烷胺半抗原a或b的溶液1缓慢滴加入所述步骤(2)的溶液2中，4℃搅拌反应过夜；以及步骤(4)将所述步骤(3)的所述反应液用0.01m pbs溶液在4℃透析3天，每天更换两次透析液；将透析液离心后，取出上清液，即为金刚烷胺抗原a或b。5.根据权利要求4所述金刚烷胺抗原a或b的制备方法制备的金刚烷胺抗原a或b。6.金刚烷胺单克隆抗体3g7，其中，所述单克隆抗体3g7的重链可变区为seq.id no 1或
其简并序列所编码，其轻链可变区为seq.id no 2或其简并序列所编码。7.一种金刚烷胺elisa检测试剂盒，其中，所述金刚烷胺elisa检测试剂盒包括包被了权利要求5所述金刚烷胺抗原a的支持介质、酶标工作液、金刚烷胺抗体工作液、金刚烷标准品溶液；其中，所述金刚烷胺抗原a的包被浓度为0.10μg/ml～0.25μg/ml；所述酶标工作液为hrp-羊抗鼠igg的溶液，优选为1∶5000～1∶8000v/v稀释；所述金刚烷胺抗体工作液为权利要求6所述的金刚烷胺单克隆抗体3g7的溶液，所述金刚烷胺单克隆抗体3g7的含量为0.04μg/ml；所述金刚烷标准品溶液是将金刚烷胺标准品用0.01m pbs稀释液梯度稀释为0、0.2ng/ml、0.6ng/ml、1.8ng/ml、5.4ng/ml、16.2ng/ml各浓度；其中，所述支持介质为微量滴定板，所述金刚烷胺抗原a包被100μl/孔；所述酶标工作液还含有：1l水中含氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、新生牛血清200ml、proclin300 1ml；所述金刚烷胺抗体工作液还含有：1l水中含氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、10g牛血清白蛋白、proclin3001ml；所述试剂盒还包括洗涤液、tmb显色液、终止液、提取剂、纯化剂、样品稀释液；所述洗涤液为含0.1％v/v吐温-20的0.01m pbs溶液；所述tmb显色液包括a液和b液，其中a液为ph值为5的柠檬酸-磷酸二氢钠的缓溶液，其为在100ml水含有1.5g柠檬酸和6.6g磷酸氢二钠、1.0g过氧化脲，b液为0.8％m/v的3,3,5,5-四甲基联苯胺的柠檬酸-磷酸二氢钠的缓冲溶液；所述终止液为2mol/l的硫酸溶液；所述提取剂为乙腈；所述纯化剂为正己烷；以及所述样品稀释液为0.01m pbs溶液。8.一种金刚烷胺生物芯片检测试剂盒，其中，所述生物芯片检测试剂盒包括一个或多个金刚烷胺芯片、抗体工作液、酶标工作液，所述金刚烷胺芯片包被有权利要求5所述金刚烷胺抗原a、质控品、空白对照点；其中，所述质控品为鼠igg，所述空白对照点为检测背景值；所述空白对照点为5％甘油溶液、5％山梨醇溶液、0.05％曲拉通溶液、dmso、pbs(ph6.8)溶液按10∶15∶0.1∶50∶100的体积比混合均匀后的点样点；所述抗体工作液为含权利要求6所述金刚烷胺单克隆抗体3g7的溶液，所述金刚烷胺单克隆抗体3g7的浓度为0.06μg/ml；所述酶标工作液为含hrp-羊抗鼠igg的溶液，按1：200～1：2000v/v稀释hrp-羊抗鼠igg；所述金刚烷胺抗原a包被量为0.6～1.0ng/点；所述鼠igg的包被量为1～4ng/点；所述质控品点共三个点，质控品点(1)的包被量为大于等于1ng/点而小于2ng/点；质控品点(2)的包被量为2ng/点；质控品点(3)的包被量为大于2ng/点而小于等于4ng/点。9.根据权利要求8所述的金刚烷胺生物芯片检测试剂盒，其中，所述的生物芯片检测试剂盒还包括提取剂、纯化剂、tmb底物液、洗涤液、样品稀释液；
所述洗涤液为含0.1％v/v吐温-20的0.01m pbs溶液；所述tmb显色液包括a液和b液，其中a液为ph值为5的柠檬酸-磷酸二氢钠的缓溶液，其为在100ml水含有1.5g柠檬酸和6.6g磷酸氢二钠、1.0g过氧化脲，b液为0.8％m/v的3,3,5,5-四甲基联苯胺的柠檬酸-磷酸二氢钠的缓冲溶液；所述终止液为2mol/l的硫酸溶液；所述提取剂为乙腈；所述纯化剂为正己烷；以及所述样品稀释液为0.01m pbs溶液。10.根据权利要求8所述的金刚烷胺生物芯片检测试剂盒，其中，所述质控品点(1)的包被量为1ng/点；所述质控品点(2)的包被量为2ng/点；所述质控品点(3)的包被量为4ng/点；将点样液作为空白对照点样于空白对照点样点(4)，将所述金刚烷胺抗原a点样于点(5)；所述质控品点(1)、所述质控品点(2)、所述质控品点(3)、所述空白对照点样点(4)分别固定于检测芯片的左上角、左下角、右下角、右上角，所述点(5)点样于所述检测芯片其他位置，与其他任一点的边缘相距≥700μm，而所述点样点(1)至(5)中点与点边缘之间的最短距离也为≥700μm；所述质控品点(1)、所述质控品点(2)、所述质控品点(3)、所述空白对照点样点(4)到检测芯片亚单元上边缘、下边缘的距离≥8mm，到检测芯片亚单元左边缘、右边缘的距离≥5mm；所述金刚烷胺生物芯片试剂盒包括一个或多个金刚烷胺生物芯片亚单元，由底端、上格栅、设置于其间由所述底端、上格栅夹紧的金刚烷胺生物芯片组成独立的检测孔，所述一个检测孔为一个所述金刚烷胺生物芯片亚单元，当所述抗体联检试剂盒包括多个金刚烷胺生物芯片亚单元时，各个所述独立的检测芯片亚单元集成为微阵列芯片。
技术总结
本发明提供了金刚烷胺半抗原A或B。经过本发明的制备方法逐步制备金刚烷胺抗原A或B。然后获得抗金刚烷胺单克隆抗体3G7，使用上述组分制备的金刚烷胺ELISA检测试剂盒和金刚烷胺生物芯片检测试剂盒，能高灵敏度和高选择性检测多种样品中的金刚烷胺，灵敏度高于国标检测方法的最低检测限，且具有快速、简便、价廉的特点。点。点。
技术研发人员：田克恭 郭江涛 彭伍平 张许科
受保护的技术使用者：洛阳中科生物芯片技术有限公司
技术研发日：2021.09.17
技术公布日：2023/3/20