利用RNA环化技术制备寡肽的方法及寡肽的表达DNA与流程

利用rna环化技术制备寡肽的方法及寡肽的表达dna
技术领域
1.本发明涉及一种利用rna环化技术制备寡肽的方法及寡肽的表达dna，属于蛋白表达技术领域。


背景技术：

2.寡肽又称为小肽、低聚肽或称为小分子活性肽，2～10个氨基酸彼此缩合形成的化合物，是多肽的一种分类。在20世纪60年代出newey和smyth(1959,1960)第一次提供了肽被完整吸收的资料。蛋白质在小肠中被消化成氨基酸与寡肽，且寡肽可以完整的进入肠粘膜细胞并水解成氨基酸进入血液循环。寡肽具有不需要消化直接吸收、吸收时不消耗能量、不增加肠胃功能负担、100％被人体吸收等特点。
3.传统的寡肽合成主要分为化学合成和生物合成。化学合成利用固相或者液相介质，将肽链依照顺序逐个添加到合成中间产物上。这种化学合成的方法适用于二肽或者三肽的合成，但是对于长一点的寡肽的合成，就会出现反应步骤多，副产物和中间产物多，产量低和提纯困难等问题。生物合成是利用生物系统的蛋白表达技术，将寡肽融合蛋白表达在宿主内部，再经过蛋白纯化和寡肽释放来获得目的寡肽。这种方法的优势是不受寡肽长度和氨基酸序列的影响，可以简单高效地合成寡肽，副产物少，也是目前工业上合成寡肽的重要方法。但这种方法对较短的寡肽难以应用，较短的寡肽如二肽或者三肽在融合蛋白中的占比极少，通过融合蛋白的表达方式往往获得的寡肽产量很低，难以应用于大规模生产。环状rna是一个共价闭合环状的rna分子，具有稳定性好、翻译效率高和免疫原性低等特点，成为基因表达、核酸药物和疫苗的重要载体工具。但是其是否可以用于寡肽的表达和纯化，目前还不得而知。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种利用rna环化技术制备寡肽的方法，生产成本低、流程简单、易规模化。
5.本发明采用的技术方案为：
6.一种利用rna环化技术制备寡肽的方法，其步骤包括：
7.(1)构建寡肽的表达dna，该表达dna包括自环化序列1-起始密码子-串联重复的寡肽编码dna-rbs序列-自环化序列2；
8.(2)将上述构建的寡肽的表达dna构建到表达载体上，转入宿主细胞中进行表达，得到融合寡肽；
9.(3)表达后的融合寡肽进行纯化；
10.(4)纯化后的融合寡肽使用蛋白酶切割分离；
11.(5)纯化分离后的寡肽。
12.优选的，所述表达dna包括自环化序列1-起始密码子-亲和标签/分泌标签/自聚集标签-串联重复的寡肽编码dna-rbs序列-自环化序列2。
13.优选的，所述自环化序列1的序列如seq id no.1所示，所述自环化序列2的序列如seq id no.2所示。
14.优选的，所述寡肽指2-50个氨基酸的小分子肽。
15.优选的，所述寡肽为二肽-1、二肽-2、ap二肽、三肽-1、三肽-5、三肽-8、谷胱甘肽、四肽-5、四肽-7、四肽-9、四肽-11、五肽-4、六肽-2、六肽-3、六肽-8、六肽-9、九肽-1、十肽-4、蓝铜肽、律波肽或胶原蛋白肽。
16.优选的，所述蛋白酶选择切割位点为寡肽的最后一个氨基酸的蛋白酶，用于将融合寡肽切割分离成单独的寡肽。
17.优选的，所述蛋白酶为糜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、内肽酶、胶原酶、凝血酶。
18.优选的，寡肽编码dna串联重复排列的数量为5-500个。
19.本发明还公开了一种寡肽的表达dna，该表达dna包括自环化序列1-起始密码子-串联重复的寡肽编码dna-rbs序列-自环化序列2。
20.优选的，所述表达dna包括自环化序列1-起始密码子-亲和标签/分泌标签/自聚集标签-串联重复的寡肽编码dna-rbs序列-自环化序列2。
21.优选的，所述自环化序列1的序列如seq id no.1所示，所述自环化序列2的序列如seq id no.2所示。
22.优选的，所述表达dna为自环化序列1-atgcatcatcatcatcatcat-(寡肽编码dna)n-ggaggagga-自环化序列2。
23.优选的，所述n为5-500之间的自然数。
24.优选的，所述表达dna为自环化序列1-atgcatcatcatcatcatcat-(ggtcacaaa)
n-ggaggagga-自环化序列2。
25.优选的，所述表达dna为自环化序列1-atgcatcatcatcatcatcat-(cacttccgt)
n-ggaggagga-自环化序列2。
26.优选的，所述表达dna为自环化序列1-atgcatcatcatcatcatcat-(ggccagccgcgt)
n-ggaggagga-自环化序列2。
27.本发明还公开了一种寡肽的表达载体，系将上述的寡肽的表达dna构建到表达载体中而成。
28.优选的，所述表达载体为pet28a。
29.本发明还公开了一种寡肽的表达宿主，含有上述的寡肽的表达载体。
30.优选的，宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌、酵母菌、植物原生质体或者动物细胞。
31.本发明的原理是将寡肽通过重复进行串联，串联后的编码框orf不包含终止密码子。当mrna被自环化序列进行环化后，环化的orf不含有终止密码子，因此可以持续地进行滚环式翻译，最终产生含有很多重复串联序列的融合蛋白。经过蛋白纯化后，利用蛋白酶将重复寡肽切割成单一寡肽，并用常规方法例如hplc纯化出目的寡肽的片段。本发明方法可以低成本快速大量合成寡肽，寡肽成品产量大，纯度高。
附图说明
32.图1本发明的流程示意图。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
34.除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
35.下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
36.实施例1rna环化技术制备寡肽方法原理介绍。
37.原理见图1，我们把寡肽的编码dna进行了多次重复串联，形成可表达多聚寡肽的融合蛋白开放阅读框orf，在最后一个重复串联上，我们进行了密码子改造，使其密码子序列偏向于表达宿主的rbs序列，这样的目的是为了保证环状rna最终能够被核糖体识别并翻译出orf编码的蛋白。在寡肽重复串联orf的下游，没有终止密码子，这样的目的是为了保证翻译能够无限持续下去，在环状rna上进行滚环多轮翻译，而不被终止。在寡肽重复串联orf的上游，我们加上了起始密码子atg和亲和标签(6个组氨酸h)，来保证翻译的起始和翻译产物能够被表达纯化出来。
38.如图1，当rna被转录出来后，两个自环化序列会将内部的rna进行环化，形成环状mrna。环状mrna上包含起始密码子atg(甲硫氨酸m)，6个组氨酸标签、串联重复寡肽序列，且最后一个串联重复序列被优化成rbs序列。
39.当rna被环化后，核糖体根据rbs序列识别翻译起始密码子atg，翻译出甲硫氨酸，翻译起始，随后6个组氨酸的标签被翻译出来，核糖体进入寡肽重复串联后，开始翻译出寡肽多聚体。当核糖体绕着环状rna翻译一周，产生一个大的蛋白重复单元。由于没有终止密码子，核糖体会继续绕着环状rna进行下一轮翻译。最终一轮一轮翻译出重复结构单元的大蛋白。
40.利用蛋白纯化技术将大蛋白进行分离纯化后，纯化的蛋白使用特异性蛋白酶进行切割，将寡肽单体释放出来。释放的寡肽单体经hplc分离纯化，获得寡肽产品。
41.实施例2rna环化技术制备三肽-1铜
42.在本实施例中，我们公布了rna环化技术制备三肽-1铜流程：
43.表达载体的设计：我们首选将三肽-1(ghk)进行密码子优化，即ggtcacaaa。我们将密码子进行1次、10次、50次、100次串联重复，在串联重复前加入起始密码子和6个组氨酸密码子标签(mhhhhhh)，atgcatcatcatcatcatcat(seq id no.3)。最后加上aggaggaaaaaa密码子来当做rbs。最终cdna序列为atgcatcatcatcatcatcat(ggtcacaaa)nggaggagga,翻译的氨基酸序列为mhhhhhh(ghk)nggg,n为串联重复的次数。这个氨基酸序列即为核糖体围绕环状rna翻译一圈后的多肽序列。当核糖体围绕环状rna翻译m圈后，翻译出的蛋白产物即为(mhhhhhh(ghk)nggg)m,蛋白产物中三肽-1(ghk)的重复拷贝数为m
×
n个。我们在cdna的两端加上自环化序列seq id no：1和seq id no：2,组成可以自环化的mrna。最终序列在艾基生
物合成，并将寡肽的表达dna构建到pet28a载体的t7启动子下游，使用t7启动子开启基因的表达，在细菌中的rna聚合酶作用下转录生成一段rna，t7启动子将特定的序列转录成rna。在这段转录后rna两端含有特定的序列使得rna环化，一方面环状的rna更为稳定，另一方面rna上因为没有添加终止密码子，因此在核糖体结合rna进行起始翻译后可以产生环化的产物。，。
44.表达菌株的获得。将构建好的带有不同重复ghk的表达载体转入到全式金生物的rossetta(de3)感受态中，冰浴30min，42℃热激60s,冰浴5min，涂布到含50mg/l的卡那霉素固体lb培养板上，37℃静置培养过夜。挑取单克隆菌株团到含50mg/l的卡那霉素液体lb培养中，200rpm，37℃恒温震荡培养至od600值达到0.6-0.8时，通过一代测序验证菌株的准确性。
45.融合蛋白制备。1000ml菌株培养至od600值达到0.6-0.8时。加入1mm终浓度iptg，30终浓度为4mm的iptg，37度200rpm继续培养过夜。10000rpm，4度离心20min，收集菌体。将菌体重悬在裂解液(20mm tris，500mm nacl，3m盐酸胍，ph 8.0)中，使用压力或超声进行菌体破碎，直至溶液澄清。12000rpm，4度离心20min，收集上清。ni-nta亲和层析柱用10倍体积裂解缓冲液充分平衡后，加入过滤后的细菌裂解液，0.5ml/min流速，再用含20mm咪唑裂解缓冲液充分清洗。最后使用200mm咪唑裂解缓冲液回收蛋白。将蛋白放到10kda超滤管中，4℃8000rpm 20min超滤浓缩，加入10ml 20mm tris(ph 8.0)，4℃8000rpm 20min超滤浓缩，重复三次。用bca定量试剂盒对蛋白进行定量。
46.蛋白酶切割和hplc纯化：取100mg纯化的总蛋白，加入50ug胰蛋白酶和0.05m cucl2溶液，室温孵育过夜。使用态创生物三肽-1铜作为标准品，在hplc中标定三肽-1铜的出峰时间。使用制备型hplc根据出峰时间进行三肽-1铜的收集。收集好的三肽-1铜经冷冻干燥后，制备成三肽-1铜成品。成品的产量和纯度如表1所示。
47.表1三肽-1铜的产量和纯度
48.三肽-1铜产量(mg/l)纯度(％)1个重复1.4662.7 10个重复43.489.1 50个重复151.398.3 100个重复192.499。
49.实施例3rna环化技术制备三肽-8
50.在本实施例中，我们公布了rna环化技术制备三肽-8流程：
51.(1)表达载体的设计：我们首选将三肽-8(hfr)进行密码子优化，即cacttccgt。我们将密码子进行1次、10次、50次、100次串联重复，在串联重复前加入起始密码子和6个组氨酸密码子标签(mhhhhhh)，atgcatcatcatcatcatcat。最后加上aggaggaaaaaa密码子来当做rbs。最终cdna序列为atgcatcatcatcatcatcat(cacttccgt)nggaggagga,翻译的氨基酸序列为mhhhhhh(hfr)nggg,n为串联重复的次数。这个氨基酸序列即为核糖体围绕环状rna翻译一圈后的多肽序列。当核糖体围绕环状rna翻译m圈后，翻译出的蛋白产物即为(mhhhhhh(hfr)nggg)m,蛋白产物中三肽-8(hfr)的重复拷贝数为m
×
n个。我们在cdna的两端加上自环化序列seq id no：1和seq id no：2,组成可以自环化的mrna。最终序列在艾基生物合成，并
构建到pet28a载体上，使用t7启动子开启基因的表达。
52.(2)表达菌株的获得。将构建好的带有不同重复ghk的表达载体转入到全式金生物的rossetta(de3)感受态中，冰浴30min，42℃热激60s,冰浴5min，涂布到含50mg/l的卡那霉素固体lb培养板上，37℃静置培养过夜。挑取单克隆菌株团到含50mg/l的卡那霉素液体lb培养中，200rpm，37℃恒温震荡培养至od600值达到0.6-0.8时，通过一代测序验证菌株的准确性。
53.(3)融合蛋白制备。1000ml菌株培养至od600值达到0.6-0.8时。加入1mm终浓度iptg，30终浓度为4mm的iptg，37度200rpm继续培养过夜。10000rpm，4度离心20min，收集菌体。将菌体重悬在裂解液(20mm tris，500mm nacl，3m盐酸胍，ph 8.0)中，使用压力或超声进行菌体破碎，直至溶液澄清。12000rpm，4度离心20min，收集上清。ni-nta亲和层析柱用10倍体积裂解缓冲液充分平衡后，加入过滤后的细菌裂解液，0.5ml/min流速，再用含20mm咪唑裂解缓冲液充分清洗。最后使用200mm咪唑裂解缓冲液回收蛋白。将蛋白放到10kda超滤管中，4℃8000rpm 20min超滤浓缩，加入10ml 20mm tris(ph 8.0)，4℃8000rpm 20min超滤浓缩，重复三次。用bca定量试剂盒对蛋白进行定量。
54.(4)蛋白酶切割和hplc纯化：取100mg纯化的总蛋白，加入50ug胰蛋白酶，室温孵育过夜。使用态创生物三肽-8作为标准品，在hplc中标定三肽-8的出峰时间。使用制备型hplc根据出峰时间进行三肽-8的收集。收集好的三肽-8经冷冻干燥后，制备成三肽-8成品。成品的产量和纯度如表2所示。
55.表2三肽-8成品的产量和纯度
56.三肽-8产量(mg/l)纯度(％)1个重复1.1354.8 10个重复15.983.3 50个重复89.196.2 100个重复128.398.5。
57.实施例4rna环化技术制备四肽-7
58.在本实施例中，我们公布了rna环化技术制备四肽-7流程：
59.(1)表达载体的设计：我们首选将四肽-7(gqpr)进行密码子优化，即ggccagccgcgt。我们将密码子进行1次、10次、50次、100次串联重复，在串联重复前加入起始密码子和6个组氨酸密码子标签(mhhhhhh)，atgcatcatcatcatcatcat。最后加上aggaggaaaaaa密码子来当做rbs。最终cdna序列为atgcatcatcatcatcatcat(ggccagccgcgt)nggaggagga,翻译的氨基酸序列为mhhhhhh(gqpr)nggg,n为串联重复的次数。这个氨基酸序列即为核糖体围绕环状rna翻译一圈后的多肽序列。当核糖体围绕环状rna翻译m圈后，翻译出的蛋白产物即为(mhhhhhh(gqpr)nggg)m,蛋白产物中四肽-7(gqpr)的重复拷贝数为m
×
n个。我们在cdna的两端加上自环化序列seq id no：1和seq id no：2,组成可以自环化的mrna。最终序列在艾基生物合成，并构建到pet28a载体上，使用t7启动子开启基因的表达。
60.(2)表达菌株的获得。将构建好的带有不同重复ghk的表达载体转入到全式金生物的rossetta(de3)感受态中，冰浴30min，42℃热激60s,冰浴5min，涂布到含50mg/l的卡那霉
素固体lb培养板上，37℃静置培养过夜。挑取单克隆菌株团到含50mg/l的卡那霉素液体lb培养中，200rpm，37℃恒温震荡培养至od600值达到0.6-0.8时，通过一代测序验证菌株的准确性。
61.(3)融合蛋白制备。1000ml菌株培养至od600值达到0.6-0.8时。加入1mm终浓度iptg，30终浓度为4mm的iptg，37度200rpm继续培养过夜。10000rpm，4度离心20min，收集菌体。将菌体重悬在裂解液(20mm tris，500mm nacl，3m盐酸胍，ph 8.0)中，使用压力或超声进行菌体破碎，直至溶液澄清。12000rpm，4度离心20min，收集上清。ni-nta亲和层析柱用10倍体积裂解缓冲液充分平衡后，加入过滤后的细菌裂解液，0.5ml/min流速，再用含20mm咪唑裂解缓冲液充分清洗。最后使用200mm咪唑裂解缓冲液回收蛋白。将蛋白放到10kda超滤管中，4℃8000rpm 20min超滤浓缩，加入10ml 20mm tris(ph 8.0)，4℃8000rpm 20min超滤浓缩，重复三次。用bca定量试剂盒对蛋白进行定量。
62.(4)蛋白酶切割和hplc纯化：取100mg纯化的总蛋白，加入50ug胰蛋白酶，室温孵育过夜。使用态创生物四肽-7作为标准品，在hplc中标定三肽-8的出峰时间。使用制备型hplc根据出峰时间进行四肽-7的收集。收集好的四肽-7经冷冻干燥后，制备成四肽-7成品，成品的产量和纯度如表3所示。
63.表3三肽-8成品的产量和纯度
64.四肽-7产量(mg/l)纯度(％)1个重复0.9545.3 10个重复18.384.6 50个重复54.297.2 100个重复88.598.8。
65.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。