一种两亲性分子、胶束及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种两亲性分子、胶束及其制备方法与应用。


背景技术：

2.两亲性分子(amphiphile)，是指同时具有亲水性和亲脂性这两种性质的化合物分子， 这类物质被称为是“两亲性”。两亲性分子具有亲水的头部和疏水的尾部，亲水头一般 由胆碱、胺盐等极性基团构成，而疏水尾部一般由长的脂肪链构成。两亲性分子在水中 可以自组装成各种不同的分子组装体，例如胶束和囊泡等。形成的组装体的结构和性能， 与两亲性分子的结构有着直接的联系。目前，两亲性分子的自组装在纳米材料中有很大 的发展，并被人们广泛利用。
3.胶束(micelle)，多由两亲性分子自组装形成，当两亲性分子的浓度达到一定值后， 开始大量形成的分子有序聚集体。在胶束中，两亲性分子的疏水基聚集构成胶束内核， 亲水的极性基团构成胶束外层。胶束的纳米核壳结构使它们适合药物的加载和输送，疏 水的内壳可用于装运疏水性药物，如dnas、rnas、蛋白质、紫杉醇等，而亲水外壳 可提高其在体内循环时的稳定性和生物相容性，可广泛应用于医药领域。
4.黑色素瘤(melanoma)，是一种由黑色素细胞引起的癌症，这种特殊的色素细胞主 要存在于皮肤中，且可以产生黑色素。黑色素瘤进展迅速，五年生存率低于10％，难以 治愈。黑色素瘤在早期可以通过手术治愈，但一旦发展到转移阶段，则难以治疗，目前 缺乏有效的药物及治疗方案。因此，急需开发新的药物和治疗方法用于高效治疗黑色素 瘤。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种 两亲性分子，可以制备成两亲性纳米胶束，用于黑色素瘤的治疗。
6.本发明还提出了上述两亲性分子的制备方法。
7.本发明还提出一种具有上述两亲性分子的胶束。
8.本发明还提出上述胶束的制备方法。
9.本发明还提出上述胶束的应用。
10.根据本发明的一个方面，提出了一种两亲性分子，所述两亲性分子由甘露糖、聚酪 氨酸和脂肪胺连接组成；其中，所述聚酪氨酸选自由2～8个酪氨酸分子聚合而成的肽链； 所述脂肪胺选自c
16
或者c
18
饱和或不饱和脂肪胺。
11.根据本发明的一种具体的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明的两亲性分子， 包含亲水性的甘露糖和聚酪氨酸肽链，以及亲脂性的脂肪链；其中，甘露糖可以靶向作 用于黑色素瘤部位，聚酪氨酸肽链分解释放出的酪氨酸，作为黑色素的合成底物，可在 体外诱导小鼠黑色素瘤代谢产生大量黑色素，并诱导其分化、抑制其增殖和迁移，具有 极高的生物安全性，为黑色素瘤的治疗提供安全可靠的技术手段，有着良好的临床应用 前景。
12.在本发明的一些实施方式中，其中，所述聚酪氨酸选自由3～6个酪氨酸分子聚合
而 成的肽链；所述脂肪胺选自c
16
或者c
18
的饱和或不饱和脂肪胺，优选为十六烯胺或十 八烯胺(油胺)。
13.在本发明的一些优选的实施方式中，所述聚酪氨酸为4个酪氨酸分子聚合而成的酪 氨酸四肽；所述脂肪胺为油胺。该两亲性分子的分子式如下所示：
[0014][0015]
在本发明中，“c
16
或者c
18
的饱和或不饱和脂肪胺”，是指碳原子个数为16或者 18个碳的饱和或不饱和的脂肪胺，主要包括烷烃链和烯烃链。
[0016]
根据本发明的再一个方面，提出了上述两亲性分子的制备方法，包括以下步骤：以 甘露糖-聚酪氨酸和脂肪胺为原料，在碳二亚胺类缩合剂和缩合活化剂存在的条件下， 进行酰胺缩合反应，得到所述两亲性分子；其中，所述甘露糖-聚酪氨酸选自甘露糖连 接的由2～8个酪氨酸分子聚合而成的肽链；所述脂肪胺选自c
16
或者c
18
饱和或不饱和 脂肪胺。
[0017]
根据本发明的一种具体的实施方式的制备方法，至少具有以下有益效果：通过该方 法可以高效制备得到本发明的甘露糖-聚酪氨酸-脂肪胺的两亲性分子。
[0018]
在本发明的一些实施方式中，所述碳二亚胺类缩合剂选自二环己基碳二亚胺 (dcc)、二异丙基碳二亚胺(dic)或1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edci)； 和/或所述缩合活化剂选自4-二甲氨基吡啶(dmap)、1-羟基苯并三唑(hobt)或n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺(nhs)。
[0019]
在本发明的一些优选的实施方式中，将甘露糖-酪氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3
‑ꢀ
乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺按照(1～1.5):2:2的摩尔比称重,并溶解在二 甲基亚砜中，惰性气体下混合0.5～1小时，随后将5当量油胺滴加到上述溶液，室温下 反应24h，产物装入透析袋(截留分子量500-1000)，分别用超纯水和乙醇交替透析， 最后产物冻干,甘露糖-酪氨酸-油胺(m-tyr-oa)白色粉末。
[0020]
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述气体氛围为氩气，溶剂为干燥级。
[0021]
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述甘露糖-酪氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)
ꢀ‑
3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺纯度在99％以上，油胺纯度在90％以上。
[0022]
根据本发明的再一个方面，提出了一种胶束，所述胶束包含上述两亲性分子。
[0023]
根据本发明的一种具体的实施方式，至少具有以下有益效果：由甘露糖、酪氨酸和 亲油性分子组成的两亲性纳米胶束，两亲性分子中甘露糖、l-酪氨酸四肽嵌段处于胶束 的外壳，油胺嵌段处于胶束内核，可显著提高酪氨酸溶解度，并高效递送至黑色素瘤细 胞和肿瘤，分解释放出酪氨酸；其分解释放出的酪氨酸对机体其他组织器官无任何副作 用，并可作为中心碳原子代谢的原料参与细胞糖酵解，具有极高的生物安全性。
[0024]
在本发明的一些实施方式中，所述胶束具有如下所示的性质中的至少一种：i)粒径 的范围为20nm～200nm；ii)胶束粒径分散指数(pdi)小于0.3。
[0025]
在本发明的一些优选的实施方式中，所述胶束具有如下所示的性质中的至少一种： i)粒径的范围约为60nm；ii)胶束粒径分散指数(pdi)约为0.6；iii)临界胶束浓度 为0.00828mg/l。
[0026]
根据本发明的再一个方面，提出了上述胶束的制备方法，包括以下步骤：将所述两 亲性分子配制成浓度为1～20mg/ml的四氢呋喃溶液；将所述四氢呋喃溶液以1～5ml/h 的速度加入水中，搅拌得到所述胶束；其中，所述四氢呋喃溶液与水的体积比为1：(2～8)。
[0027]
在本发明的一些优选的实施方式中，包括以下步骤：称取一定量步骤(1)中获得 的甘露糖-酪氨酸-油胺，配制成5ml四氢呋喃溶液(1～5mg/ml)，用蠕动泵将其注射 到20ml超纯水中(2ml/h)，搅拌1h，随后将溶液装入透析袋(截留分子量7000)， 用超纯水透析，并用超滤管浓缩，得到所需浓度的酪氨酸纳米胶束(m-tyr-oanp)。
[0028]
根据本发明的再一个方面，提出了上述胶束在制备产生黑色素药物中的应用。
[0029]
根据本发明的再一个方面，提出了上述胶束在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
[0030]
在本发明的一些实施方式中，所述治疗黑色素瘤药物为通过光热疗法杀伤黑色素瘤 的药物。
[0031]
本发明至少具有以下有益效果：本发明的胶束分解释放出的酪氨酸，作为黑色素的 合成底物，可在体外诱导小鼠黑色素瘤代谢产生大量黑色素，并诱导其分化、抑制其增 殖和迁移；另外，经静脉注射后，该胶束可在甘露糖的靶向作用下到达黑色素瘤部位， 在体内显著抑制黑色素瘤的生长和转移。本发明的胶束可实现酪氨酸的可控高效递送， 且在抑制恶性黑色素瘤的生长和转移方面具有显著效果，同时未靶向到肿瘤部位的酪氨 酸胶束，在体内降解后释放出的酪氨酸对机体无任何副作用，且可作为生物体中心碳原 子代谢的原料，参与机体代谢，生物安全性极好；最后，该胶束诱导黑色素瘤产生的大 量代谢产物黑色素，可被利用于后续治疗(如光热治疗等)；因此，该胶束可用于抑制 恶性黑色素瘤的生长和转移，且具有非常高的生物安全性，为黑色素瘤的治疗提供安全 可靠的技术手段，有着良好的应用前景。
附图说明
[0032]
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
[0033]
图1为本发明实施例1中制备得到的甘露糖-酪氨酸四肽-油胺两亲分子的核磁波谱 图及其在水中自组装形成酪氨酸胶束的透射电镜(tem)图、其水合粒径，及临界胶束 浓度图；
[0034]
图2为本发明实施例2中不同浓度酪氨酸胶束与三种正常细胞共培养不同时间后
的 细胞活性图；
[0035]
图3为本发明实施例3中hacat细胞在不同培养基条件下处理24h后中心碳源子代 谢相关基因的表达图；
[0036]
图4为本发明实施例4中显示酪氨酸胶束被黑色素瘤细胞内吞且可诱导细胞产生大 量黑色素的实验结果图，其中，a为共聚焦荧光成像图，b为细胞成像图，c为细胞中黑 色素含量图；
[0037]
图5为本发明实施例5中酪氨酸胶束抑制黑色素瘤细胞的增殖和转移的实验结果 图；其中，a为细胞活性统计图，b为细胞周期分布图，c为细胞伤口愈合实验图，d为 细胞transwell侵袭实验图；
[0038]
图6为本发明实施例6中酪氨酸胶束对小鼠黑色素瘤的靶向性实验的活体荧光成像 图；
[0039]
图7为本发明实施例7中酪氨酸胶束抑制小鼠体内黑色素瘤的生长和转移实验图， 显著延长小鼠生存期，其中，a为实验小鼠肿瘤照片，b为肿瘤生长曲线，c为小鼠生存 率曲线，d为免疫组化图；
[0040]
图8为本发明实施例酪氨酸胶束通过光热疗法杀伤黑色素瘤细胞的实验图，其中， a为不同激光照射时间下的热成像图，b为细胞活性统计图，c为细胞活死染色图。
具体实施方式
[0041]
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充 分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施 例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动 的前提下所获得的其它实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法， 如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途 径得到的试剂和材料。
[0042]
在本发明的实施例中，两亲性分子具体为含有酪氨酸的两亲性分子，在下面的实施 例中，将其制备形成的胶束称为酪氨酸胶束。
[0043]
实施例1：酪氨酸胶束的制备与表征
[0044]
1.1酪氨酸胶束的制备，包括以下步骤：
[0045]
(1)将甘露糖-酪氨酸四肽(m-tyr)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐、n-羟基琥珀酰亚胺按照(1～1.5):2:2的摩尔比称重，并溶解在二甲基亚砜中，惰 性气体下混合0.5～1小时，随后将5倍当量油胺(oa)滴加到上述溶液，室温下反应 24h，产物装入透析袋(截留分子量500-1000)，分别用超纯水和乙醇交替透析，最后产 物冻干，得到甘露糖-酪氨酸四肽-油胺(man-tyr-oa)白色粉末。
[0046]
甘露糖-酪氨酸四肽-油胺分子的制备过程如图1中a所示，即通过m-tyr和oa进 行酰胺缩合得到。得到的甘露糖-酪氨酸四肽-油胺进行质谱和核磁数据分析，其质谱图 如图1中b所示，核磁氢谱图如图1中c所示，其质谱和核磁数据证明合成的甘露糖
‑ꢀ
酪氨酸四肽-油胺的结构正确。
[0047]
(2)称取一定量步骤(1)中获得的甘露糖-酪氨酸四肽-油胺，配制成5ml浓度为 2mg/ml(在另一些实施例中，也可以使用浓度范围为1～5mg/ml)的四氢呋喃溶液， 用蠕动
泵将其注射到20ml超纯水中(2ml/h)，搅拌1h，随后将溶液装入透析袋(截 留分子量7000)，用超纯水透析，并用超滤管浓缩，得到所需浓度的酪氨酸胶束。
[0048]
酪氨酸胶束的制备过程如图1中d所示，甘露糖-酪氨酸四肽-油胺分子通过上述步 骤，自组装形成胶束。
[0049]
制备得到的甘露糖-酪氨酸四肽-油胺(man-tyr-oa)的化学式为：c
60h83
n5o
13
，分 子式为：
[0050][0051]
在本实施例中，c
18
的不饱和脂肪链作为亲脂性片段，还可以使用c
16
的不饱和脂肪 链替代；同时，酪氨酸四肽也可选择其它的酪氨酸聚合度形式的片段，如2～8个酪氨酸 的聚合片段。
[0052]
1.2酪氨酸胶束的表征
[0053]
实验结果如图1所示：合成了甘露糖-酪氨酸四肽-油胺，并成功将其制备成酪氨酸 胶束。透射电镜(transmission electron microscope，tem)图显示(图1e)，其粒径尺 寸大小范围20nm-200nm之间，平均粒径约为60nm，水合粒径的动态光散射(dynamiclight scattering，dls)图(图1f)显示，其水合粒径平均值为123nm，酪氨酸纳米胶 束pdi＝0.160，具有良好的分散性。通过检测，酪氨酸胶束的临界胶束浓度为0.00828mg/l (图1g)。
[0054]
本发明还可以通过上述方法合成不同聚合度的酪氨酸多肽(例如2～8个酪氨酸分子 聚合的多肽)的两亲性分子和胶束，本实施例中使用四聚酪氨酸片段，是由于其可以提 高酪氨酸溶解度，且合成成本合适。
[0055]
实施例2：酪氨酸纳米胶束对正常细胞具有优异的生物安全性
[0056]
2.1酪氨酸纳米胶束在1mg/ml下对3种正常细胞系增殖活性检测。
[0057]
1)细胞培养：将人表皮细胞hacat，小鼠单核巨噬细胞raw264.7用含10％胎牛 血清和1％双抗的rpmi1640高糖培养基，人胚胎肾细胞hek293t用含10％胎牛血清和 1％双抗的dmem高糖培养基，在饱和湿度、5％co2、37℃条件下培养、传代。
[0058]
2)细胞增殖活性测定：取对数生长期的三种正常细胞，用完全培养基制成细胞密 度为1
×
105/ml的单细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl，于饱和湿度、5％co2、 37℃条件培养。24h后，分别加入含0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml酪氨酸胶束的完全 培养基，对照组更换为新正常完全培养基，各6个复孔，分别继续培养24h，48h和72h 后，各孔加入100μl的cck-8细胞检测液，在置培养箱种继续培养1h后，用酶标仪检 测其在405nm处的吸光度(od值)，以对照组相对增殖活性100％计，按照公式酪氨酸 胶束处理组相对增殖活性(％)＝处理组od值
÷
对照组od值
×
100％，计算相对增殖活 性。
[0059]
实验结果如图2所示，显示了不同浓度的酪氨酸胶束与三种细胞共培养不同时间后 的细胞活性，表明酪氨酸胶束对于正常细胞的安全性。结果显示，酪氨酸胶束对三种正 常细胞具有优异的安全性，在1mg/ml浓度以内与细胞共培养72h后，对细胞增殖活性 无明显影响，并有一定的促增殖活性。
[0060]
实施例3：酪氨酸胶束对中心碳原子代谢相关基因表达的影响研究
[0061]
1)取对数生长期的hacat细胞，用完全培养基制成细胞密度为1
×
105/ml的单细 胞悬液，接种于24孔板，每孔500μl，于饱和湿度、5％co2、37℃条件培养。24h后， 处理组更换为低糖培养，含0.1mg/ml酪氨酸胶束的低糖培养基，对照组更换为新正常 培养基，各3个复孔，分别继续培养24h后加trizol(rna提取试剂)收取细胞组织， 提取mrna；
[0062]
2)rt-qpcr检测中心碳原子代谢相关基因akt1、met、pfkl、pik3r2、pfkm、hk1、 pik3cd、mapk3、pkm、acss2、eno3等mrna的表达量；
[0063]
实验结果如图3所示，与正常培养基培养的细胞相比，低糖培养下的hacat细胞的 中心碳原子代谢相关基因下调，说明低糖环境抑制了细胞相关的能量代谢；而加入酪氨 酸后，为hacat细胞提供了碳源，促进糖酵解和糖异生，相关基因的表达得到恢复。该 实验结果说明，实施例1合成的酪氨酸胶束在低糖环境下，可上调正常细胞中心碳原子 代谢相关基因的表达；其不仅对正常细胞无明显毒性，且在低糖环境下可为细胞代谢提 供碳源，上调中心碳原子代谢相关基因的表达，作为正常营养物质参与细胞代谢。
[0064]
实施例4：酪氨酸胶束诱导黑色素瘤细胞产生大量黑色素
[0065]
4.1细胞吞噬实验
[0066]
取对数生长期的小鼠黑色素瘤b16f10细胞，用完全培养基制成细胞密度为1
×ꢀ
105/ml的单细胞悬液，接种于共聚焦皿中，每孔1ml，于饱和湿度、5％co2、37℃条 件培养。24h后，加入含0.5mg/ml连接了fitc的酪氨酸胶束培养基，置37℃条件下 继续培养2h、4h和6h后置共聚焦显微镜下，观察细胞对酪氨酸胶束的内吞情况。
[0067]
4.2黑色素瘤细胞内黑色素含量检测
[0068]
取对数生长期的小鼠黑色素瘤b16f10细胞，用完全培养基制成细胞密度为1
×ꢀ
105/ml的单细胞悬液，接种于6孔板中，每孔1ml，于饱和湿度、5％co2、37℃条件 培养。24h后，加入含(0、0.5和1mg/ml)酪氨酸胶束的培养基，置37℃条件下继续 培养48h或72h后，收集细胞(约1
×
106)并溶解在100μl的1m浓度naoh-10％dmso 溶液，在80℃下放置2小时，通过测量405nm处的吸光度，并将结果与合成黑色素(sigma，m8631)生成的标准曲线进行比较，测定黑色细胞内素含量。
[0069]
实验结果如图4所示，从图4a可以看出，由于酪氨酸胶束的两亲性，在与黑色素 瘤细胞共培养细胞2h后，即可被细胞内吞，且随时间吞噬量增加。酪氨酸胶束进入细 胞内后
分解释放出的酪氨酸，可作为黑色素合成的底物，诱导黑色细胞产生大量黑色素， 其中酪氨酸胶束(1mg/ml)与黑色素瘤细胞共培养72h后的光镜照片，如图4b所示， 与对照组细胞相比有显著升高(图4c)。结果证明，酪氨酸胶束可在2h左右高效被黑色 素瘤细胞内吞，且能诱导黑色素瘤细胞产生大量黑色素。
[0070]
实施例5：酪氨酸胶束体外抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖和转移的能力
[0071]
5.1酪氨酸胶束抑制黑色素瘤细胞增殖
[0072]
1)细胞增殖活性检测：将1中的同浓度的b16f10细胞接种于96孔板，每孔100μl。 24h后，分别加入含0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml酪氨酸胶束的完全培养基，对照组 更换为新正常完全培养基，各6个复孔，分别继续培养24h、48h和72h后，各孔加入 100μlcck-8细胞检测液，在置培养箱中继续培养1h后，用酶标仪检测其在405nm处 的吸光度(od值)，以对照组相对增殖活性100％计，按照公式酪氨酸胶束处理组相对增 殖活性(％)＝处理组od值
÷
对照组od值
×
100％，计算相对增殖活性。
[0073]
2)细胞周期检测：
[0074]
将b16f10细胞(约5
×
105个细胞/孔)接种在6孔板中，24小时后，用含有0、0.5 或1mg/ml酪氨酸胶束的新鲜培养基替换培养基。于37度继续孵育48小时后，用胰蛋 白酶消化收集细胞，然后用冷乙醇(70％)固定2小时。细胞用pi染色，并使用分析流 式细胞仪，检测530nm处的荧光以分析细胞周期分布，每个实验重复三份。
[0075]
5.2利用伤口愈合和transwell实验分析细胞迁移和侵袭
[0076]
1)伤口愈合实验：
[0077]
将b16f10细胞(约5
×
105个细胞/孔)接种在6cm2小皿中，24小时后，用含有0、 0.5或1mg/ml酪氨酸胶束的新鲜培养基替换培养基。于37度继续孵育48小时。吸去 培养基，用200μl灭菌枪头，比着直尺画一条垂直的竖线，保持力度一致。用pbs洗 去划下的细胞2-3次，更换无血清培养基，放入37度培养箱，12、24、48后小时拍照 观察，用imagej软件对伤口愈合率进行量化统计分析，每个样品选取3个视野拍照， 每组3个重复。
[0078]
2)transwell实验
[0079]
用无血清培养基将matrigel胶按1:10稀释，包被到transwell小室底部膜，置37度 放置1h，使matrigel聚合成凝胶，使用前水化处理。将b16f10细胞(约5
×
105个细胞 /孔)接种在6cm2小皿中，24小时后，用含有0、0.5或1mg/ml酪氨酸胶束的新鲜培养 基替换培养基。于37度继续孵育48小时。用胰蛋白酶消化收集细胞，用无血清培养基 制成1
×
106个细胞/ml悬液，在每个transwell小孔上室加入200μl细胞悬液，下室加 入完全培养基1ml。置37度培养箱继续培养72h，通过结晶紫染色，统计transwell小 室膜上细胞的数量。
[0080]
实验结果如图5所示，酪氨酸胶束可显著抑制黑色素瘤细胞的增殖活性，且成浓度 和时间依赖性。通过周期检测可知，酪氨酸胶束可将共培养的黑色素瘤的细胞周期抑制 在g1期，从而抑制其增殖(图5b)；通过细胞伤口愈合及transewell实验结果可知，经 过酪氨酸处理后的黑色素瘤细胞的迁移和侵袭能力均显著降低(图5c和d)。实验结果 证明，酪氨酸胶束可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞b16f10的增殖和转移。
[0081]
实施例6：酪氨酸胶束对小鼠体内黑色素瘤的靶向性研究
[0082]
取3只6周左右的c57小鼠，脱毛后，每只小鼠于左后肢接种～1
×
106个黑色素瘤 细胞。2周后，每只小鼠静脉注射5mg/ml连接了cy5.5的酪氨酸胶束100μl，分别于 3h、6h、
12h通过小鼠活体成像仪观察酪氨酸胶束在肿瘤部位的富集情况。
[0083]
实验结果如图6所示：酪氨酸胶束在3h左右在肿瘤部位有富集，且随时间的增加 而增多，12h时可观察到肿瘤部位有较强的荧光强度，说明连接有甘露糖的酪氨酸胶束 对黑色素瘤有良好的靶向作用。
[0084]
实施例7：酪氨酸胶束抑制小鼠体内黑色素瘤的生长和转移
[0085]
取10只6周左右的c57小鼠，随机分为两组，即对照组和酪氨酸处理组；脱毛后， 每只小鼠于左后肢接种约1
×
106个黑色素瘤细胞，待肿瘤长至80mm3左右，对照组小 鼠每隔1天静脉注射100μl的pbs，酪氨酸组每隔1天静脉注射100μl浓度为5mg/ml 的酪氨酸纳米胶束。每隔3天拍照记录肿瘤的大小，并记录小鼠生存曲线。另15天时， 每组小鼠取一只肿瘤，固定包埋做免疫组化，观察转移相关蛋白mmp2和mmp9的表 达。
[0086]
实验结果如图7所示，与对照组相比，酪氨酸处理组小鼠肿瘤生长得到了显著抑制， 生存期显著延长(图7a、b和c)。通过免疫组化结果可以看出，处理组小鼠转移mmp2 和mmp9的表达显著降低(图7d)。实验结果显示，酪氨酸胶束具有抑制小鼠体内黑色 素瘤的生长和转移的功能。
[0087]
实施例8：酪氨酸胶束通过光热疗法杀伤黑色素瘤细胞
[0088]
取对数生长期的小鼠黑色素瘤b16f10细胞，用完全培养基制成细胞密度为1
×ꢀ
105/ml的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μl。24h后，分别加入含0.5mg/ml、 1mg/ml酪氨酸胶束的完全培养基，对照组更换为新正常完全培养基，各6个复孔，分 别继续培养48h后，酪氨酸处理组每孔用808nm激光器照射5min(0.28w/cm2)，用热 成像仪检测孔内温度。之后继续置37度培养箱培养6h，各孔加入100μlcck-8细胞检 测液检测细胞活性。
[0089]
实验结果如图8所示，与对照组相比，酪氨酸处理组细胞经808nm激光照射5min 后，温度上升到约50度(图8a)。在该温度下，黑色素瘤细胞的活性显著下降，细胞出 现大量死亡，与对照组、单独激光处理组、单独酪氨酸处理组细胞活性相比，具有十分 显著的统计学差异(图8b和c)。实验结果证明，酪氨酸胶束诱导黑色素瘤产生的黑色 素，在近红外激光照射下，具有光热转化能力，产生热效应可以高效杀伤黑色素瘤细胞。 因此，酪氨酸胶束诱导黑色素瘤产生的黑色素，可作为光热试剂，通过光热疗法杀伤黑 色素瘤细胞。
[0090]
本实施例的胶束由一种酪氨酸两亲性分子在水溶液中自组装形成，两亲性分子由亲 水性的甘露糖、l-酪氨酸四肽和亲油性油胺组成，两亲性分子中甘露糖、l-酪氨酸四肽 嵌段处于胶束的外壳，油胺嵌段处于胶束内核。实验结果证明，该酪氨酸胶束分解释放 出的酪氨酸，作为黑色素的合成底物，可在体外诱导小鼠黑色素瘤代谢产生大量黑色素， 并诱导其分化、抑制其增殖和迁移；另外，经静脉注射后，该酪氨酸胶束可在甘露糖的 靶向作用下到达黑色素瘤部位，在体内显著抑制黑色素瘤的生长和转移。本发明的酪氨 酸胶束可实现酪氨酸的可控高效递送，且在抑制恶性黑色素瘤的生长和转移方面具有显 著效果，同时未靶向到肿瘤部位的酪氨酸胶束，在体内降解后释放出的酪氨酸，对机体 无任何副作用，且可作为生物体中心碳原子代谢的原料，参与机体代谢，生物安全性极 好；最后，酪氨酸胶束诱导黑色素瘤产生的大量代谢产物黑色素，可被利用于后续治疗 (如光热治疗等)。
[0091]
综上所述，该酪氨酸胶束可用于抑制恶性黑色素瘤的生长和转移，且具有非常高的 生物安全性，为黑色素瘤的治疗提供安全可靠的技术手段，有着良好的应用前景。
[0092]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在
所 属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下， 作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互 组合。