专用于diego血型基因测序的引物组及试剂盒和方法
技术领域
1.本发明涉及基因诊断制品技术领域，具体为一种专用于diego血型基因测序的引物组及试剂盒和方法。
背景技术：
2.diego血型系统的基因是slc4a1，该基因编码的蛋白质是阴离子交换剂家族的一部分，在红细胞质膜中表达，作为氯化物/碳酸氢盐交换剂参与二氧化碳从组织到肺的转运。slc4a1基因位于染色体17q21.31，包含20个外显子。
3.diego血型系统目前发现有23个抗原，具有重要的临床意义。血型不合会引发溶血性输血反应和新生儿溶血病，甚至危及患者生命。每个抗原对应特定的等位基因，可通过对突变位点进行检测来确定。现有技术通常通过桑格法或者高通量测序，获得diego血型基因的目标序列，然后与标准序列进行比对。桑格法测序需要选定目标序列，设计测序引物，测序的结果片段因人而异，所测序列的质量和准确度也因待测对象和引物的不同而不同。高通量测序能够获得较长的目标序列，然而较为耗时费力，而且成本高，只有特殊样本有需求才用。
4.目前可供digeo血型基因分型方法有很多可供选择，例如pcr
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ssp、荧光pcr法等。但这些方法在设计引物时只能针对某些具有区别性的特异性位点进行设计，因此只能对产品检测内的特异性位点进行分型，对于一些特殊的或新的突变位点则难以明确。
技术实现要素：
5.本发明要解决的技术问题是克服现有技术中由于基因突变的发生使得digeo血型基因的测定困难，提供一种专用于diego血型基因测序的引物组及试剂盒和方法。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
7.专用于diego血型基因测序的引物组，包括14外显子扩增用引物对p1，16外显子扩增用引物对p2和19外显子扩增用引物对p3；
8.其中14外显子扩增用引物对p1的序列为：
9.p1f：atcttccaggaccacccact；
10.p1r：gaacttgcgcagcatcatgg。
11.16外显子扩增用引物对p2的序列为：
12.p2f：aaactctcggtgcctgatgg；
13.p2r：atgggaaactcggaacgcaa。
14.19外显子扩增用引物对p3的序列：
15.p3f：gcatgcacttattcacgggc；
16.p3r：ggcacagtgaggatgaggac。
17.可以将这些引物组应用于制备专用于diego血型基因测序的制品中，选择slc4a1基因的外显子14、16、19分三段进行pcr扩增，一方面是针对diego血型基因主要的突变位
点；另一方面是缩小扩增的目标范围和序列长度，提高扩增的效率和准确度；该引物组能有效避开目前为止发现的突变位点。与其它diego血型基因测序的引物组相比，扩增效率高，匹配准确度高，可降低检测成本。
18.一种人类diego血型基因测序的试剂盒，包括上述的14外显子扩增用引物对p1，16外显子扩增用引物对p2和19外显子扩增用引物对p3、pcr扩增预混物，凝胶，凝胶稀释液，其它辅助试剂。
19.优选的，14外显子扩增用引物对p1，16外显子扩增用引物对p2和19外显子扩增用引物对p3的浓度10～100pm。
20.检测必须但试剂盒中不包括的组分：
21.1.5ml离心管(用于配置pcr反应液和dna提取)；
22.0.2ml pcr管或8联管pcr管或96孔pcr板；
23.带滤塞的吸头(1ml、200μl和10μl)；
24.dna提取试剂盒或者自配dna提取试剂；
25.琼脂糖凝胶。
26.一种人类diego血型基因测序的方法，包括以下步骤：
27.s1、利用14外显子扩增用引物对p1，16外显子扩增用引物对p2和19外显子扩增用引物对p3分别扩增slc4a1基因的14、16、19外显子；pcr扩增程序：可根据所使用的酶进行优化，变性条件根据使用的pcr仪型号和反应管种类进行设定，变性再94℃～98℃，5～30sec。通常94℃时设定为20～30sec、98℃时设定为5～10sec。
28.s2、对扩增片段用凝胶进行纯化；
29.s3、用三对引物进行桑格法测序，正反向结果合并.
30.本发明所达到的有益效果是：
31.本发明提供一种专用于diego血型基因测序的试剂盒和方法，优化选择包含突变位点的等位基因的关键片段，并加入配套的扩增试剂和纯化程序，实现对目标等位基因的桑格法测序。本试剂盒以人血液提取的基因组dna为检测样本，用于slc4a1基因14、16和19外显子多种突变的定性检测，通过比较检测样本序列与genebank参考序列(ng_007498.1)之间的差异判断样本是否发生突变，为diego血型的基因型和表型确定提供基础数据，进而辅助临床诊断。本发明提供的专用于diego血型基因测序的引物组可以解决digeo血型的抗原鉴定、疑难血型的判断、新突变位点的发现、基因多态性检测等问题。
具体实施方式
32.以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
33.实施例
34.dna提取：一般取edta抗凝血样2ml，磁珠法自动提取dna，测量od(260/280)＝1.9。
35.pcr扩增：
36.1、pcr工作液配制：水500μl与taq酶10μl加入pcr缓冲液管中，混匀离心。
37.2、pcr工作液与样本dna混和液配制：加入1微升正向和反向测序引物(10pmoles)反应管，40mlpcr缓冲液和4mldna进行pcr反应。
38.pcr扩增程序：
39.步骤温度和时间循环196℃ 6min1cycle296℃ 15sec，68℃ 60sec30cycles396℃ 20sec，65℃ 50sec，72℃ 45sec10cycles472℃ 2min1cycle54℃保存 40.或则pcr扩增程序：
41.步骤温度和时间循环198℃ 7min1cycle298℃ 10sec，55℃ 30sec，72℃ 45sec30cycles372℃ 2min1cycle44℃保存 42.变性条件根据使用的pcr仪型号和反应管种类进行设定，94℃时设定为20～30sec、98℃时设定为5～10sec。
43.三对特异性引物序列的tm＝60℃，p1的产物长度为147bp，p2的产物长度为92bp，p3的产物长度为109bp。
44.凝胶电泳提纯：将扩增产物进行pcr凝胶电泳提纯，选取扩增的目标片段400bp左右。凝胶纯化步骤极大的提高了扩增产物的纯度，有利于桑格法测序获得准确的结果。
45.上机测序，使用三对测序引物，abi公司3500xl测序仪，分段测序。
46.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。