一种乙醇处理制备饲养层的方法及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乙醇处理制备饲养层的方法及其应用。


背景技术：

2.多能干细胞，包括胚胎干细胞(es)和诱导多能干细胞(ips)，具有自我更新和多向分化的能力，从而在组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。多能干细胞体外培养需要有饲养层细胞作为基质，提供营养。evans和kaufman(1981)最早从小鼠的内细胞团分离得到小鼠胚胎干细胞时，参照体内微环境，在培养皿里铺一层经过丝裂霉素c处理的小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层。经过处理的小鼠胎儿成纤维细胞失去了分裂增殖能力，可以为胚胎干细胞的贴壁、增殖和信号传导等提供多方面的支持，维持多能干细胞自我更新能力。所以，之后包括人胚胎干细胞(thomson(1998)以及2006年出现的诱导性多能干细胞(takahashi and yamanaka(2006)，都是沿用处理过的饲养层培养细胞。
3.传统标准的饲养层制作过程，包括小鼠胎儿成纤维细胞(mef)的分离培养，丝裂霉素c或者射线照射处理，胰酶消化，计数，重新将mef接种到预先铺有明胶的培养皿里，经过至少12小时培养，细胞贴壁展开后，才可以使用，并且最好是现做现用。整个制作过程复杂，废工耗时。另外，使用传统饲养层还可能带来细胞交叉污染的问题。
4.近年来建立了许多无饲养层培养体系用于培养多能干细胞，包括matrigel、laminin(joseph et al.2001)、fibronectin(amit et al.2004)、vitronectin(braam et al.2008)、hydrogel(gerecht et al.2007)、以及一些合成材料(mahlstedt et al.2010)等。这些细胞基质一般价格较昂贵，有些多能干细胞用这些基质后会出现细胞分化和凋亡等现象，不能很好的维持干细胞的自我更新，因此，无饲养层体系还无法完全替代传统的饲养层培养方法。
5.综上所述，现迫切需要一种操作简单、效率高、不会引起细胞交叉污染的饲养层制备方法。


技术实现要素：

6.为此，本发明实施例提供一种乙醇处理制备饲养层细胞的方法及其应用，以解决上述现有技术中存在的问题。
7.为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
8.第一方面，本发明实施例提供了一种乙醇处理制备饲养层的方法，包括以下步骤：
9.s1、将饲养层细胞接种在培养皿上，加入适量培养液，盖上培养皿盖，然后置于培养环境中培养至饲养层细胞密度达到80％
‑
90％；
10.s2、将接种有饲养层细胞的培养皿自培养环境中取出，打开培养皿盖，去掉培养液，用缓冲液洗饲养层细胞一遍，之后去掉缓冲液，然后向培养皿中加入无水乙醇，盖上培养皿盖，之后室温下放置5min；无水乙醇的加入量为s1中培养液加入量的1/2；
11.s3、5min后，打开培养皿盖，去掉无水乙醇，再将培养皿敞口放置4
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6min，得到饲养
层，然后盖上培养皿盖，将培养皿封口后室温下保存备用。
12.优选地，s1中的饲养层细胞包括小鼠胎儿成纤维细胞、人皮肤成纤维细胞、建系的成纤维细胞中的一种。
13.优选地，s1中的培养液由85％的高糖dmem和15％的fbs组成。
14.优选地，s1中的培养环境为37℃、5％co2细胞培养箱。
15.优选地，s1中，将饲养层细胞置于培养环境中培养1
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2天。
16.优选地，s2中的缓冲液位磷酸盐缓冲液。
17.优选地，s2中，向培养皿中加入无水乙醇前，将无水乙醇置于4℃的环境中冷藏10
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20min。
18.第二方面，本发明实施例提供了上述饲养层在培养多功能干细胞方面的应用。
19.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
20.(1)本发明提供的一种乙醇处理制备饲养层的方法，首先，可以用原代成纤维细胞(如mef、hdf)，也可以用建系的成纤维细胞(nih3t3)制作饲养层，省去了动物饲养、原代细胞分离培养等步骤。其次，传统的饲养层制作需要将mef用价格昂贵的丝裂霉素c处理2
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3小时，然后细胞才可以用于铺板制备饲养层。之后还需要重新消化计数，而本发明采用成本低廉的乙醇，将生长在培养皿中的细胞处理5分钟即可，无需再铺板等制备环节。最后，传统的饲养层制作方法(合拢小鼠—分离12.5天的孕鼠的mef细胞—mef细胞传代培养—丝裂霉素c的处理)，整个流程需要2
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3周时间，而本发明所用的饲养层细胞，不需要进行分离培养，只需要1
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2天时间，显著提高了效率。
21.(2)传统的饲养层细胞经过处理后，虽然细胞失去了分裂能力，但是一旦饲养层细胞被支原体等污染，就会迅速的蔓延到共培养的多能干细胞上，影响多能干细胞的增殖能力，严重时多能干细胞会出现衰老和凋亡。而本发明实施例提供的饲养层制备方法中，基质细胞经过乙醇处理后被固定在培养皿的底部，即使出现支原体污染，其污染源也会被乙醇杀死，不会因为饲养层细胞的污染而影响到共培养的多能干细胞的生长。
22.(3)传统的饲养层培养方法，多能干细胞传代时经胰酶消化，下面的饲养层细胞也会被消化起来，所以做好的饲养层只能用一次。而本发明实施例提供的饲养层制备方法中，用胰酶处理将多能干细胞消化后，被固定的饲养层细胞仍能保持完整的形态不被破坏，所以可以重复利用多次。
23.(4)传统的饲养层制作方法，小鼠胎儿成纤维细胞经过丝裂霉素c(或钴源射线)处理后，或直接用于制备饲养层，或将处理后的细胞分装、冻存在液氮中，用时再重新复苏。而本发明实施例提供的饲养层制备方法中，基质细胞经过乙醇处理后，可以直接利用，也可以风干后置于室温下长期保存，且随时可取用。
24.(5)在传统的饲养层上培养多能干细胞，很难开展药物筛选和构建稳转细胞系的实验，因为，药物会将饲养层细胞一起杀死。通过本发明实施例提供的饲养层制备方法制备出的饲养层培育的多能干细胞，可以直接开展药物处理和筛选实验，药物只能对多能干细胞发挥作用，而对乙醇处理后的饲养层细胞无影响，从而有利于建立稳转细胞系。
25.(6)本实施例提供的一种乙醇处理制备饲养层的方法，具有操作简单，节省成本，效率高、使用方便的优点。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的附图。
27.以下附图仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，任何形式的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的的前提下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
28.图1为本技术实施例实验1中人皮肤成纤维细胞在经过步骤2的乙醇处理前后的微观形态；
29.图2为本技术实施例实验2中人多能干细胞在经过乙醇处理和丝裂霉素c处理的饲养层细胞上的形态特征；
30.图3为本技术实施例实验3中人多能干细胞在丝裂霉素c和乙醇处理的饲养层细胞上的多能基因表达情况；
31.图4为本技术实施例实验4中人多能干细胞在不同饲养层细胞上的标志性蛋白oct4的表达情况。
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明请进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
33.在本发明的描述中，术语“包括”、“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包括了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于已明确列出的那些步骤或单元，而是还可包含虽然并未明确列出的但对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元，或者基于本发明构思进一步的优化方案所增加的步骤或单元。
34.实施例
35.本实施例提供了一种乙醇处理制备饲养层的方法，包括以下步骤：
36.步骤1、饲养层细胞的培养
37.本实施例所用的饲养层细胞既可以是原代分离的细胞，例如，小鼠胎儿成纤维细胞(mef)、人皮肤成纤维细胞(hdf)，也可以是建系的成纤维细胞(nih3t3)。以mef细胞为例，接种约1x104小鼠胎儿成纤维细胞在35mm培养皿(直径为35mm的培养皿)，所需培养液体积是2毫升，培养液配方是：85％高糖dmem+15％fbs，(fbs：胎牛血清)，放置在37℃、5％co2细胞培养箱培养，1
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2天后待其密度达到80
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90％，就可以用乙醇处理。相对于需要分离原代小鼠胎儿成纤维细胞来说，建系的nih3t3细胞可以省去分离培养细胞这一步骤，节省时间。
38.步骤2、乙醇处理
39.待饲养层细胞在培养皿(以35mm皿为例)中的密度达到80
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90％，从细胞培养箱取出，去掉饲养层细胞培养液，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗一遍，然后去掉pbs。从4℃冰箱取出提前预冷的无水乙醇，移液枪吸取1毫升冷乙醇，贴壁加入培养皿，室温放置5分钟。去掉乙醇，敞口放置在超净台上使乙醇挥发干净(此过程大约需要5分钟)，得到饲养层，然后盖上培养
皿盖，用封口膜将培养皿封口，立即使用或室温保存备用。饲养层细胞经过乙醇处理，细胞死亡，形态收缩，用之前加入相应的多能干细胞培养液，又可恢复到正常形态。
40.本实施例还提供了利用上述饲养层培育多能干细胞的方法，具体操作如下：
41.培养多能干细胞时，将用上述制备方法制备出的饲养层取出，去掉封口膜，加入相应的多能干细胞培养液，此时经过乙醇处理的饲养层细胞又恢复到自然的正常形态，然后接种多能干细胞正常培养即可。多能干细胞可以在该饲养层上连续传代到30代以后，依然可以维持其正常形态和多能性。由于饲养层细胞经过乙醇处理后已经死亡，所以在用来培养多能干细胞时不额外消耗培养液，相对于传统方法要节省一半的培养液，而且在多能干细胞消化传代时，胰酶等消化酶不会破坏本专利技术制备的饲养层细胞形态，所以可以重复利用2
‑
3次。
42.本实施例还提供了几组实验，以说明本发明的有益效果。
43.实验1
44.分别观察人皮肤成纤维细胞(hdf)在经过步骤2的乙醇处理前后的微观形态(放大倍数200倍)，结果如图1所示。图1中，标有hdf者为乙醇处理前的细胞形态，标有et
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hdf者为乙醇处理后的细胞形态。
45.实验2
46.观察人多能干细胞在经过乙醇处理(et
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hdf)和丝裂霉素c处理(mmc
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mef)的饲养层细胞上的形态特征(放大倍数200倍)，结果如图2所示。图2中，标有ksr的一行为人多能干细胞在含有ksr的培养液中的形态特征，标有mtesr的一行为人多能干细胞的在mtesr培养液中的形态特征。
47.实验3
48.统计人多能干细胞在丝裂霉素c和乙醇处理的饲养层细胞上的多能基因表达情况，结果如图3所示。图3中，mmc
‑
ksr代表培养在丝裂霉素c处理的饲养层细胞上的用含有ksr培养液培养的人多能干细胞，et
‑
ksr代表培养在乙醇固定处理的饲养层细胞上的用含有ksr培养液培养的人多能干细胞，mmc
‑
mtesr代表培养在丝裂霉素c处理的饲养层细胞上的用mtesr培养液培养的人多能干细胞，et
‑
mtesr代表培养在乙醇固定处理的饲养层细胞上的用mtesr培养液培养的人多能干细胞。
49.实验4
50.观察人多能干细胞在不同饲养层细胞上的标志性蛋白oct4的表达特征。图4中，标有oct4一列代表人多能干细胞的特异性标志蛋白的免疫荧光染色结果。标有dapi一列代表人多能干细胞的细胞核染色结果。标有merge一列代表oct4和dapi两张图片重合在一起的结果。结果表明，乙醇固定制备的饲养层细胞培养的多能干细胞标志蛋白oct4确实位于细胞核中，且与丝裂霉素c处理组的效果相同。
51.以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述；这些未明确写出的实施例，也都应当认为是本说明书记载的范围。
52.上文中通过一般性说明及具体实施例对本发明作了较为具体和详细的描述。应当指出的是，在不脱离本发明构思的前提下，显然还可以对这些具体实施例作出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。