一种大肠杆菌及其在高产制备d
‑
脯氨酸中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株能够生产d
‑
脯氨酸的大肠杆菌，以及利用该菌种发酵生产d
‑
脯氨酸的方法及应用。
背景技术：
2.d
‑
脯氨酸是一种重要的非天然氨基酸，其结构式如下所示：d
‑
脯氨酸是多种生物活性化合物的前体，可以被用于合成血清淀粉样p成分消耗剂、抗肿瘤创新药吡咯替尼、偏头痛药物依来曲普坦等药物，还可以作为抗菌肽的基本结构单元。除此之外，由于其拥有良好的构象刚性，也经常作为非对称合成的有机催化剂来使用。例如可以使用d型脯氨酸来催化交叉羟醛缩合反应以得到不同构象的产物。
3.现行的d
‑
脯氨酸合成主要是通过化学法来实现，通过合成外消旋脯氨酸、酒石酸拆分等多步工艺进行制备，在工业生产上，化学法步骤繁琐，污染环境。因此，开发更为环保的d
‑
脯氨酸不对称合成方法具有重要的应用价值。
4.生物工作者对手性d
‑
脯氨酸合成的合成也做了一些尝试。以外消旋脯氨酸作为底物，使用具有手性选择性的假丝酵母（jp 95
‑
289275）或解木糖赖氨酸芽孢杆菌（cn111424060a）将l
‑
脯氨酸消除，从而获得剩余的d
‑
脯氨酸。然而此类动力学拆分的方法，d
‑
脯氨酸的理论收率最高仅为50%，造成大量浪费。
5.因此，需要进一步开发高效制备d
‑
脯氨酸的方法。
技术实现要素：
6.本发明针对现有技术的不足，提供了一种高产d
‑
脯氨酸的大肠杆菌及其发酵生产d
‑
脯氨酸的应用方法。
7.本发明首先提供大肠杆菌菌株（escherichia coli）timdp1，该菌株已于2021年8月13日保藏于中国典型微生物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学内)，保管编号为cctcc no：m 20211024。
8.本发明的大肠杆菌可用于生产d
‑
脯氨酸，因而本发明提供所述大肠杆菌在生产d
‑
脯氨酸中的应用。
9.本发明进一步提供一种使用所述的大肠杆菌timdp1制备d
‑
脯氨酸的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：通过发酵培养所述大肠杆菌timdp1，并从发酵液中获得d
‑
脯氨酸。
10.其中发酵培养基中以葡萄糖为碳源、以硫酸铵为氮源，更优选地，在发酵培养基中
的葡萄糖添加量为2%
‑
6%（w/v）；所述的硫酸铵的添加量为1%
‑
3%。
11.在优选实施方式中，所述液体发酵培养所用的培养基配方为：所述发酵培养的培养基的配方为：k2hpo
4 12
‑
16g，kh2po
4 4
‑
8g，mgso4·
7h2o 100
‑
300mg，(nh4) 2
so
4 12
‑
28g，mnso
4 1
‑
3 mg，fe
2 (so4)
3 20
‑
40 mg，zncl
2 3
‑
10 mg，cacl
2 100
‑
200 mg，葡萄糖 20
‑
60 g，h2o 1l。更优选地，所述液体发酵培养所用的培养基配方为：k2hpo
4 14 g，kh2po
4 6 g，mgso4·
7h2o 200 mg，(nh4) 2
so
4 20 g，mnso
4 1 .7 mg，fe
2 (so4)
3 25 mg，zncl
2 7 mg , cacl
2 140 mg，葡萄糖 25 g，h2o 1l。
12.在优选实施方式中，所述发酵培养是在培养温度为30
‑
37℃，转速为800
‑
1200 rpm的发酵罐中。更优选地，所述发酵培养是在培养温度为30℃，转速为1000 rpm。
13.本技术人从水环境中微生物种群筛选分离出能够代谢葡萄糖合成d
‑
脯氨酸的大肠杆菌并进行持续迭代选育而获得了一株可产少量d
‑
脯氨酸的大肠杆菌timdp，并进一步通过d
‑
脯氨酸合成能力增强的基因改造而工程菌株大肠杆菌timdp1。经过实验验证，改造后的大肠杆菌timdp1d
‑
脯氨酸合成能力得到大大增强，具有较大的应用价值。
具体实施方式
14.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
15.实施例1、构建高产d
‑
脯氨酸的大肠杆菌工程菌株本发明人通过收集水环境中微生物种群，通过常规分离培养120种大肠杆菌菌落，以色谱检测代谢物的方法，筛选分离出能够代谢葡萄糖合成d
‑
脯氨酸的大肠杆菌并进行持续迭代选育，获得了一株可产少量d
‑
脯氨酸的大肠杆菌timdp（具体实验数据见后续实施例，此处不重复提供产d
‑
脯氨酸的实验过程和实验结果）。
16.经过代谢流分析，d
‑
脯氨酸的生物合成途径应该为葡萄糖经糖酵解途径，进入三羧酸循环，进而生成谷氨酸后，继续发生代谢反应后产生的。因此，以大肠杆菌timdp为出发菌株，在对谷氨酸代谢途径进行强化后，改造后的菌株应该具备更强的d
‑
脯氨酸生成能力。具体是在yghx和trpr位置整合proba(ptrc启动子)，菌株改造构建方法具体如下：(一) ptrc99
‑
proba(ptrc启动子)的构建在网站uniprotkb (https://www. uniprot. org/)找到prob genbank (ba77911.2)和proa genbank (baa77912.2)的序列 (prob 在proa上游，在其中间加一段linker,序列为: ggagcaggctg) ，通过分子克隆操作，整合到通用质粒ptrc99 lac operator后面，得到完整自ptrc99
‑
proba质粒，然后以此质粒为模板扩增得到消除lac操纵子的组成型质粒ptrc99
‑
proba,并以此质粒为模板扩增从启动子到终止子的序列。
17.所用引物信息如下：消除lac操纵子的引物信息：lac
‑
f：ttgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagacca；lac
‑
r：attgttatccgctcacaat tccacacat tatacgagccgg。
18.pcr条件： 98℃ 3 min,98℃ 30 s ，55℃ 30 s,72℃ 3 min, 25cycle,72℃ 5 min ，4℃保存。然后gbison连接得到组成型质粒ptrc99
‑
proba。
19.扩增从启动子到终止子的序列引物信息如下：ptrc
‑
proba
‑
f：gccgacatcataacggttctggcaaatattctga；ptrc
‑
proba
‑
r：tcaggctgaaaatcttctctcatccgccaaaac。
20.pcr条件: 98℃ 3 min，98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min，25 cycle，72℃ 5 min，4℃保存。
21.(二) yghx 打靶片段的构建(yghx
‑ꢀ
up
‑
proba
‑
down)从ncbi公共数据库中，打开e. coli基因组，查找yghx序列并标记，找到yghx上下游同源臂序列(大约650p)，导入到目的基因(ptrc
‑
proba)的两端，并设计引物。引物信息如下：yghx
‑
up
‑
f：ttattccgttgcgaagacctggcatyghx
‑
up
‑
r：taggtttatctcttacgggattacgtcptre99
‑
proba
‑
f：cccgtaagagataaacctatggcaaatattctgaaatgagcptre99
‑
proba
‑
r：agtaatccagcaactcttgtgggaaatctttggcggtyghx
‑
down
‑
f：agtaatccagcaactcttgtgggaaatctttggcggtyghx
‑
down
‑
r：tcggcgtattttcatcgacgcgatgaga。
22.tre
‑
proba pcr条件：98℃ 3 min，98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min，25 cycle，72℃ 5 min，4℃保存。
23.yhx
‑
uppcr条件98℃ 3 min, 98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，25 cycle，72℃ 5 min，4℃保存。
24.yghsx
‑
downpcr条件: 98℃ 3 min, 98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，25 cycle，72℃ 5 min，4℃保存。
25.将yghx的上下游片段up、down以及ptrc99
‑
proba(t1dna)通过pcr扩增出来后，将三个片段作为模板放在同一体系中再进行一次pcr扩增。扩增体系(50
µ
l) ;模板：yghx
‑
up
ꢀꢀꢀ1µ
lptrc99
‑
proba
ꢀꢀꢀ1µ
lyghx
‑
down
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1µ
l引物: yghx
‑
up
‑
f:
ꢀꢀ1µ
lyghx
‑
down
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1µ
lddh2o:
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2o
µ
l酶primer star
ꢀꢀꢀꢀꢀ
25
µ
lpcr条件：98℃ 3 min, 98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 4 min，25 cycle，72℃ 5 min，4℃保存。
26.(三)trpr打靶片段的构建(trpr
‑
up
‑
proba
‑
down)从ncbi公共数据库中，打开e. coli基因组，查找该序列并标记，找到trpr上下游同源臂序列(大约650p)，导入目的基因(ptrc
‑
proba)的两端，并设计引物。引物信息如下：trpr
‑
up
‑
f：tcccgctggcttacaacgatctttrpr
‑
up
‑
r：aatatgtcgccattgttagcgggggaagcaaaatgcctptrc99
‑
proba
‑
f：acaatgccgacatatttggcaaatattctgaaatgagcptrc99
‑
proba
‑
r：atccgcattcggtgggccgttgcttcgcaacgttcaaat
trpr
‑
down
‑
f：caccgaatgccggatgcggcgtgaatrpr
‑
down
‑
r：tctgtgcgaccaccaccaatcccgcta。
27.pcr条件：98℃ 3 min，98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min，25 cycle，72℃ 5 min，4℃保存。
28.将trpr的上下游片段up、down以及ptrc启动子的ptrc99
‑
proba扩增出来后，将三个片段作为模板放在同一体系中再进行一次pcr扩增。扩增打靶片段体系(50
µ
l) ：模板：trpr
‑
up
‑
f
ꢀꢀꢀ1µ
ltrpr
‑
up
ꢀꢀꢀꢀ1µ
lptrc99
‑
proba
ꢀꢀꢀꢀꢀ1µ
l引物：trpr
‑
up
‑
f:
ꢀꢀ1µ
ltrpr
‑
down
‑
r
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1µ
lddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2o
µ
l酶：primer star
ꢀꢀꢀ
25
µ
lpcr条件：98℃ 3 min，98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 4 min，25 cycle，72℃ 5 min，4℃保存。
29.（四）yghx和trpr的n20的选择和质粒的构建通过cripsy
‑
feb网络平台，输入要敲除的基因yghx和trpr，设计n20序列，然后通过pcr扩增，构建yghx和trpr的对应n20质粒。
30.yghx的n20：agatttgtcataacggggcgtrpr的n20：cagaacagcgtcaccaggagpecgrna
‑
yghx
‑
n20和pecgrna
‑
trpr
‑
n20的引物信息如下，pecgrna
‑
yghx
‑
n20
‑
f：agatttgtcataacggggcggttttagagctagpecgrna
‑
yghx
‑
n20
‑
r：cgccccgttatgacaaatctactaaaagccagpecgrna
‑
trpr
‑
n2o
‑
f：cagaacagcgtcaccaggaggttttagagctagaaatpecgrna
‑
trpr
‑
n2o
‑
r：ctcctggtgacgctgttctgactaaaagcca。
31.pcr的体系yghx(50
µ
l)：酶：primerstar
ꢀꢀꢀꢀ
25
µ
lpecgrna
‑
yghx
‑
n20
‑
f 1
µ
lpecgrna
‑
yghx
‑
n20
‑
r
ꢀꢀ1µ
lpecgrna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1µ
lddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
22
µ
lpcr的体系trpr(50
µ
l)：酶：primerstar
ꢀꢀꢀꢀ
25
µ
lpecgrna
‑
trpr
‑
n20
‑
f
ꢀꢀꢀꢀ1µ
lpecgrna
‑
trpr
‑
n20
‑
r
ꢀꢀꢀꢀ1µ
lpecgrna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1µ
lddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
22
µ
l。
32.pcr条件：98℃ 3 min, 98℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 3 min，25 cycle，72℃ 5 min，4℃保存。
33.gibson自连(20
µ
l体系)：pecgrna
‑
yghx
‑
n20 (pecgrna
‑
trpr
‑
n20)
ꢀꢀ
15
µ
l重组酶
ꢀꢀꢀꢀ1µ
l5xbuffer
ꢀꢀꢀꢀ4µ
l条件：50℃ 30min转化：将gibson产物(20
µ
l)转到dh5α中涂spe板，在37℃培养。
34.在spe板上挑单克隆于5ml lb试管中过夜培养，第二天提质粒，测浓度(一般在100
‑
200ng/
µ
l)，送测。
35.选择测序正确的pecgrna
‑
yghx
‑
n20和pecgrna
‑
trpr
‑
n20序列作为敲基因的pecgrna。
36.（五）电转感受态的制备5.1将带有peccas质粒的timdp宿主菌从
‑
80℃取出放入冰盒，超净台内在lb平板（kan抗性）上划线，37℃过夜培养。
37.5.2将平板取出挑单克隆于5ml lb（kan抗性）试管中37℃摇床过夜培养5.3将过夜培养的timdp
‑
peccas试管取出，取500
µ
l于50ml lb摇瓶中培养(kan抗性)，加入500
µ
l 20%阿拉伯糖诱导，37℃ 200rpm培养。待od=0. 5
‑
0.6将摇瓶取出，冰浴10min, 4℃ 4000rpm 离心10min，弃上清。
38.加入等体积(50 ml) 10%甘油重悬，4℃4000 rpm高心15in弃上清。
39.加入50%体积(25 ml) 10%甘油重悬，4℃4000 rpm 离心15min,，弃上清。
40.加入30%体积(15 ml) 10%甘油重悬，4℃4000 rp pm 高心15 min,弃上清。
41.加入20%体积(10 ml) 10%甘油重悬，4℃ 4000 rpm离心15 min,弃上清。
42.加入1%体积(500
µ
l)10%甘油重悬、分装至5支无菌的1.5ml ep管中，每支100
ꢀµ
l，放入冰中。
43.（六）电转化100
ꢀµ
l timdp
‑
peccas感受态细胞，100 ng pecgrna
‑
yghx
‑
n20)质粒，400 ng打靶片段(yghx
‑
up
‑ꢀ
proba
‑
down)/trpr
‑
up
‑
proba
‑
down,冰浴2 min后全部转入电转杯中，转化后加入1 ml lb吸入ep管中37℃180rpm培养1小时。4000 rpm离心3 min,吸出1 ml上清液，100
ꢀµ
l重悬涂在kan+spe+双抗板上，37℃过夜培养。
44.（七）验证yghx和trpr的pecgrna敲除在双抗板kan+spe+上挑若干个单克隆于300
ꢀµ
l lb(10mm鼠李糖+kan) (10mm鼠李糖可诱导pcas表达sgrna用于切割pecgrna)中37℃培养3
‑
4小时，后取1
ꢀµ
l作pcr的模板，用up和down最末端引物进行pcr鉴定，其余菌液继续培养。
45.验证pecgrna是否降解，将阳性克隆菌液划线于双抗板san+spe+和单抗板kan+上于37℃培养，若双抗板kan+spe+板上不长菌，单抗版kan+上长菌，说明pecgrna已经成功切除。
46.（八）消除yghx和trpr的peccas分别挑kan+板上的两个单克隆于两个50 ml lb(含有5g/l葡萄糖)试管中过夜培养，然后取10
µ
l涂布在含有5 g/l葡萄糖和10 g/l蔗糖的平板上，过液培养，然后挑单克隆于300
ꢀµ
l lb中37℃培养3
‑
4小时，在kan抗性和无抗平板上划线，kan+平板上没长菌而无抗
板上长菌则说明peccas消除成功，在无抗板上挑单克隆于5 ml lb中，37℃过夜培养后保菌。该菌株为timdp1。
47.选取验证正确的菌株，并于2021年8月13日保藏于中国典型微生物保藏中心，保管编号为cctcc no：m 20211024。
48.实施例2、高产d
‑
脯氨酸菌株摇瓶发酵验证将保存于甘油管中的大肠杆菌菌株timdp1划线接种至lb固体培养基基平板，同时接种大肠杆菌菌株timdp作为对照，37℃培养箱培养12
‑
24小时。挑取lb固体培养基上的大肠杆菌一环，接种于装有5 ml lb液体培养基的30 ml试管中，培养温度为37℃，置于转速为100 rpm的摇床上培养12
‑
16 h至对数期后期，即可获得菌株种子液。
49.在装有30 ml发酵培养基（k2hpo
4 14 g/l，kh2po
4 6 g/l，mgso4·
7h2o 200 mg/l，(nh4) 2
so
4 20 g/l，mnso
4 1 .7 mg/l，fe
2 (so4)
3 25 mg/l，zncl
2 7 mg/l, cacl
2 140 mg/l，葡萄糖 25 g/l）的250 ml三角瓶中接入1%种子液，于30℃、150 rpm摇床上培养，当细胞od600达到0.5时，加入0.02%阿拉伯糖诱导谷氨酸代谢途径相关酶的表达。其后通过定时取样测定发酵液d
‑
脯氨酸含量并进行hplc检测。
50.经过检测，三次重复实验结果表明，24 h发酵后，接种有大肠杆菌timdp1的摇瓶中产生了1.8
ꢀ±
0.2g/l的d
‑
脯氨酸，而作为对照组的大肠杆菌timdp的药瓶中d
‑
脯氨酸含量仅仅为0.06
±
0.01 g/l。说明d
‑
脯氨酸前体合成途径的加强对d
‑
脯氨酸的生物合成具有重要促进作用，d
‑
脯氨酸的产量得到极大的增加。
51.实施例3、高产d
‑
脯氨酸菌株高密度发酵生产d
‑
脯氨酸将保藏于甘油管中的大肠杆菌菌株timdp1划线接种至lb固体培养基平板，37℃培养箱培养16 h。挑取lb固体培养基上的大肠杆菌一环，接种于装有5 ml lb液体培养基的30 ml试管中，培养温度为37 ℃，置于转速为100 rpm的摇床上培养12
‑
16 h至od600达到1，即可获得菌株种子液。
52.将该种子液按5%的接种量加入到含有1 l （k2hpo
4 14 g/l，kh2po
4 6 g/l，mgso4·
7h2o 200 mg/l，(nh4) 2
so
4 20 g/l，mnso
4 1 .7 mg/l，fe
2 (so4)
3 25 mg/l，zncl
2 7 mg/l, cacl
2 140 mg/l，葡萄糖 25 g/l）发酵培养基的2 l发酵罐中。其后于30℃、1000 rpm、融氧度为饱和30%发酵培养。当葡萄糖耗尽时，适量补入少量葡萄糖，保持糖浓度不超过1 g/l。当细胞od600达到30左右时，加入0.02%阿拉伯糖诱导前体供应通路，发酵过程中使用硫酸铵将ph保持在7.0。发酵过程中适时取样测定d
‑
脯氨酸含量并进行hplc检测。
53.经过检测，三次重复实验结果表明，发酵36小时后，细胞od600达到60
±
5。经过检测，结果表明，d
‑
脯氨酸含量达到36
±
3 g/l。
54.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。