1.本发明涉及胍基丁胺技术领域，具体涉及一种胍基丁胺的制备方法。
背景技术：
2.胍基丁胺(agmatine)又称为鲱精胺，分子式c5h
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n4，一种内源性可乐定置换物质(clonidine displacing substance,cds)，是咪唑啉受体的激动剂α
2-肾上腺素能受体的非儿茶酚胺配体。它存在于生物体多种组织和细胞中,在生物体代谢中起到重要作用，具有多种生物学功能。在心血管系统，胍基丁胺能降低心率、平均动脉压、左室压、外周血管阻力指数等；在泌尿系统，胍基丁胺能增加肾小球过滤率和绝对近端冲吸收；在胃肠道，胍丁胺能增加胃酸和胃蛋白酶的分泌，使粘膜厚度变薄，恶化应激引起的粘膜病变等；在糖代谢条件中，胍丁胺能增加胰岛素的分泌，此外，近年的研究表明，胍基丁胺还能抑制多种细胞(包括血管平滑肌细胞、星型胶质细胞、内皮细胞、肝癌细胞和肾小管上皮细胞等)的增殖。随着人们对胍基丁胺生理作用研究的深入，胍基丁胺显示了广阔的临床应用前景，特别是在神经系统中的应用前景尤其引入注意。在食品、化工、药物制备和临床等领域，国内外需求巨大，市场应用前景广阔。
3.胍基丁胺的生产方法主要有化学法和生物酶法。化学法路线步骤多、收率低、成本高、不适合大规模的工业化生产。生物酶法主要是使用精氨酸脱羧酶(argininedecarboxylase，ec 4.1.1.19)，这是一种5'-磷酸吡哆醛(辅酶plp)依赖型的脱羧酶。该酶可以l-精氨酸为底物，经脱羧基后生成胍基丁胺。但转化率还有待提高，申请号201510535382.2的专利公开了一种利用高产精氨酸脱羧酶的重组菌生产胍基丁胺的方法，该方法将来源于大肠杆菌escherichia colibl21中编码精氨酸脱羧酶的基因(spea)过量表达于e.coli bl21(de3)中，获得了一株含精氨酸脱羧酶重组菌株pet20b(+)-adc。该酶在大肠杆菌内诱导表达后，表现出较高的活性。发酵得到的菌体可直接用于转化，通过对转化条件进行优化，在37℃条件下，转化周期需要4-6h，胍基丁胺产量达到14.3g/l，转化率为96.5％。除了通过大肠杆菌诱导表达，今年来又发现枯草芽孢杆菌也能诱导表达精氨酸脱羧酶。枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能形成芽孢，是一些重要工业酶制剂的生产菌。刘锦妮构建了hema和heml基因的表达载体，将两个表达载体分别电转化至b.subtilis 1a747感受态细胞中，获得重组菌，用麦芽糖进行诱导表达，结果表明得到较大量的谷氨酰t-rna还原酶蛋白和谷氨酰t-rna合成酶蛋白，并促进了枯草芽孢杆菌中精氨酸脱羧酶的合成，重组菌的发酵上清液中精氨酸脱羧酶的含量最高为46.75mg/l。但如何能提高枯草杆菌诱导表达的精氨酸脱羧酶转化生成胍基丁胺的转化率，是需要解决的问题。
技术实现要素：
4.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种胍基丁胺的制备方法。本发明制备方法简单，耗能低，无污染，胍基丁胺的转化率高、成本低。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明提供一种胍基丁胺的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将含有精氨酸脱羧酶的发酵液调ph值至4.2～4.6，再依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤，得到滤液，滤液用镍柱进行亲和层析，再将精氨酸浆液加入到镍柱中，然后分次加入plp，控制镍柱中液体的ph值为4.8～5.2，收集镍柱中流出的液体，即为胍基丁胺转化液；
8.(2)胍基丁胺转化液进行过膜、第一次脱色、电渗析、第一次浓缩、第一次分离得到胍基丁胺粗品；粗品再经重溶、第二次脱色、第二次浓缩、搅拌养晶、第二次分离得到胍基丁胺精品，最后干燥得到固体胍基丁胺。
9.优选的，步骤(1)中，发酵液调ph值至4.4；陶瓷膜的孔径为100nm，压力0.5mpa；滤液亲和层析使用、50mm的pbs作为结合缓冲液。
10.优选的，步骤(1)中，所述精氨酸浆液的制备方法为：将l-精氨酸加入纯水中，加入30wt％浓盐酸调ph到5.5-6.0，降温至38℃，得到精氨酸浆液；所述精氨酸浆液的浓度为300g/l。
11.优选的，步骤(1)中，所述精氨酸浆液的流速为50cm/h；所述plp的加入量为精氨酸浆液的0.03-0.04wt％。
12.优选的，步骤(2)中，所述过膜是将胍基丁胺转化液通过抽滤依次经过硅藻土铺成的铺层和活性炭层铺成的铺层；所述活性炭的用量占胍基丁胺转化液的0.5wt％，所述硅藻土的用量占胍基丁胺转化液的0.5wt％。
13.优选的，步骤(2)中，所述第一次脱色为：用活性炭在75℃下脱色40min；所述活性炭的用量为胍基丁胺转化液的1.5wt％。
14.优选的，步骤(2)中，所述电渗析的ph控制在5.7～6.1，温度控制在40℃以下；淡室电导≤1000μs/cm时，关闭电渗析，将淡水放出；第一次浓缩是将电渗析放出的淡水通过旋转蒸发浓缩至400～450g/l。
15.优选的，步骤(2)中，所述重溶为：粗品按照150g/l重溶，重溶温度60℃；所述第二次脱色为：将重溶液加入5～10wt
‰
的活性炭，60℃脱色30min得到脱色液，脱色液抽滤，使滤液的透光度达到98％以上；所述第二次浓缩为滤液旋转蒸发浓缩至400～450g/l。
16.优选的，步骤(2)中，所述搅拌养晶为：搅拌下于常温结晶。
17.优选的，步骤(2)中，第一次分离时，粗品用0.5～1倍体积的纯水洗涤，水洗液回流至第一次脱色重复使用；第二次分离时，搅拌养晶得到的精品用1～2倍体积的纯水洗涤，水洗液回流至第一次脱色重复使用。上述操作均称为母液套用。
18.本发明的有益效果：
19.(1)本发明采用固定化酶法，将含有精氨酸脱羧酶的发酵液进行过滤，然后将精氨酸脱羧酶挂在镍柱上，再向镍柱中加入含有l-精氨酸的精氨酸浆液，通过精氨酸脱羧酶将l-精氨酸转化为胍基丁胺。
20.(2)本发明制备方法简单，易操作，耗能低、无污染；可以实现胍基丁胺的工业化生产，而且胍基丁胺的收率有了显著提高。
21.(3)本发明的方法成本低，只需以镍柱为转化场所，镍柱从开始使用至失效，可以转化10～15t l-精氨酸。
具体实施方式
22.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
23.正如背景技术所述，目前以l-精氨酸为底物通过生物酶法制备胍基丁胺所用的精氨酸脱羧酶，通常用基因工程重组生产菌来生产得到精氨酸脱羧酶。这类精氨酸脱羧酶一般以胞含体形式存在，以l-精氨酸为底物制备胍基丁胺时，需要将菌体中的精氨酸脱羧酶进行一系列的提取纯化，工艺较为复杂。
24.基于此，本发明提供一种胍基丁胺的制备方法，该方法采用固定化酶法直接将破菌后的发酵液挂镍柱，精氨酸脱羧酶的生产菌在前期设计时，在优化后的基因末端增加了gly-arg-gly-8his序列，此序列类似于一个“小尾巴”，生产菌生产得到的精氨酸脱羧酶带着这个“小尾巴”，通过它挂在镍柱上。再在镍柱中加入l-精氨酸，通过镍柱上的精氨酸脱羧酶将l-精氨酸转化为胍基丁胺。本发明无需对发酵液中的精氨酸脱羧酶进行提取纯化，制备胍基丁胺的方法简单易操作，成本低，全程无任何污染产生。
25.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
26.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
27.实施例1：
28.1.制备精氨酸脱羧酶生产菌
29.发明人从现有数据库中获得的spea基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
30.(1)为了使spea基因能够更适用于原核表达系统，本发明分别对上述基因的核苷酸序列组成进行了密码子优化，并在优化后的spea基因的末端增加了gly-arg-gly-8his序列，如seq id no.2所示；得到优化后的spea基因(即目的基因)，如seq id no.3所示。
31.(2)对pg3启动子进行优化得到优化后的pg3启动子(seq id no.4所示)，将质粒pht304用ndeⅰ和hincⅱ双酶切处理，将优化后的pg3启动子整合在双酶切处理后的质粒pht304上，得到质粒pht304-pg3(seq id no.5所示)；
32.(3)将质粒pht304-pg3用sphⅰ和sacⅰ双酶切处理，将目的基因(seq id no.3所示)整合到双酶切处理后的质粒pht304-pg3上，得到重组表达载体(seq id no.6所示)。
33.2.精氨酸脱羧酶生产菌的构建
34.将重组表达载体导入枯草芽孢杆菌中，获得转化子。
35.将转化子在lb平板上涂布，等长出单菌落之后在amp平板(含50μg/ml amp的lb平板)上接种，待抗性平板上长出单菌落之后，amp平板中挑出生长的单菌落，将其作为阳性转化子。
36.将阳性转化子接种于发酵培养基(发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/l、酵母膏8g/l、氯化钠3g/l、硫酸铵2.5g/l、三水磷酸氢二钾4g/l、柠檬酸铁铵0.3g/l、柠檬酸2.1g/l、甘油10g/l、七水硫酸镁0.5g/l、硫酸卡那霉素100ppm、消泡剂0.5g/l，接种前用氨水调发酵培养基ph至6.9-7.0)中，发酵培养的温度为37℃，ph为6.9～7.0，溶氧(do)为20～40％；od为20％时，降温至28℃，加入0.2mm iptg诱导发酵；保证诱导培养时间不少于14h，待od增长缓
慢或不长时发酵结束。对培养后得到的发酵液进行破菌处理，4000r/min离心15min，收集上清液得到含有精氨酸脱羧酶的发酵液。
37.实施例2
38.(1)将实施例1得到的发酵液用浓盐酸调ph为4.42，再依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤(陶瓷膜的孔径是100nm，压力0.5mpa)处理，得到滤液；滤液加入至镍柱使精氨酸脱羧酶挂柱，结合缓冲液是50mm的pbs。精氨酸加少量纯水溶成300g/l的精浆液，加入30％浓盐酸调ph到5.7，降温，定容备用。精氨酸浆液降温至38℃后，加入到镍柱中，分批次加入plp，plp总占比为精浆液质量的0.03wt％，过程ph用浓盐酸控制在5.0左右。收集镍柱中流出的液体，即为胍基丁胺转化液。
39.(2)过膜：胍基丁胺转化液过用0.5wt％硅藻土和0.5wt％活性碳铺成的过滤层(硅藻土铺在在活性碳层的上方)，抽滤；
40.第一次脱色：用占胍基丁胺转化液1.5wt％的活性炭，在75℃条件下脱色40min；
41.电渗析：将脱色液泵入电渗析设备中，用稀盐酸或氨水调节料液ph至5.9，开启电渗析，ph控制在5.9，温度控制在40℃以下，淡室电导≤1000μs/cm时，关闭电渗析，将淡水放出。
42.第一次浓缩：开启真空泵，将淡水打入旋蒸瓶中，然后开启水浴锅，控制水浴锅温度75℃，开启冷却水进行冷凝，浓缩至450g/l，然后将料液放出。
43.第一次分离：将浓缩液离心得到粗品，用1倍湿品体积的纯水洗晶体，水洗液(母液)回流至第一次脱色工序重复使用(母液套用)。
44.重溶：粗品按照150g/l重溶，重溶温度60℃。
45.第二次脱色：将重溶液加入占重溶液质量10wt
‰
的活性炭，60℃脱色30min，脱色液进行抽滤使得到的滤液透光度达到98％以上。
46.第二次浓缩：开启真空泵，将脱色抽滤后的滤液打入旋蒸瓶中，然后开启水浴锅，控制水浴锅温度75℃，开启冷却水进行冷凝，浓缩至450g/l，然后将料液放出。
47.搅拌养晶：精浆液缓慢搅拌，降至常温结晶。
48.第二次分离：将浓缩液离心得到精品，用2倍湿品体积的纯水洗晶体，洗至出口检测无硫酸根残留，水洗液(母液)回流至第一次脱色工序重复使用(母液套用)。
49.干燥：将精品置于干燥装置中60℃干燥。
50.包装：精品干燥结束后，根据客货粒度要求进行粉碎，包装，得到成品。
51.对比例1
52.(1)胍基丁胺转化液的制备：与实施例2中的步骤(1)相同。
53.(2)过膜：胍基丁胺转化液过用0.5wt％硅藻土和0.5wt％活性碳铺成的过滤层，抽滤；
54.脱色：用1.5wt％活性炭在75℃条件下脱色40min；
55.电渗析：将脱色液泵入电渗析设备中，用稀盐酸或氨水调节料液ph至5.9，开启电渗析，ph控制在5.9，温度控制在40℃以下，淡室电导≤1000μs/cm时，关闭电渗析，将淡水放出。
56.浓缩：开启真空泵，将淡水打入旋蒸瓶中，然后开启水浴锅，控制水浴锅温度75℃，开启冷却水进行冷凝，浓缩至450g/l，然后将料液放出。
57.分离：将浓缩液离心得到胍基丁胺，用1倍湿品体积的纯水洗晶体，粗母液水洗液回用至电渗析前脱色工序。
58.干燥：将胍基丁胺置于干燥装置中60℃干燥。
59.包装：精品干燥结束后，根据客货粒度要求进行粉碎，包装，得到成品。
60.对比例2
61.(1)胍基丁胺转化液的制备：与实施例2中的步骤(1)相同。
62.(2)脱色：将胍基丁胺转化液加入10wt
‰
的活性炭，60℃脱色30min，脱色液进行抽滤，使滤液的透光达到98％以上。
63.浓缩：开启真空泵，将抽滤后的滤液打入旋蒸瓶中，然后开启水浴锅，控制水浴锅温度75℃，开启冷却水进行冷凝，浓缩至450g/l，然后将料液放出。
64.搅拌养晶：精浆液缓慢搅拌，降至常温结晶。
65.分离：将浓缩液离心得到精品，用2倍湿品体积的纯水洗晶体，洗至出口检测无硫酸根残留，精母液水洗液回用至电渗析前脱色工序。
66.干燥：将精品置于干燥装置中60℃干燥。
67.包装：精品干燥结束后，根据客货粒度要求进行粉碎，包装，得到成品。
68.对比例3
69.采用原始投酶转化的方法进行转化
70.1.底物制备：将150克精氨酸加纯水溶成300g/l的精浆液，加入30wt％浓盐酸调ph到5.7，降温备用。
71.2.转化过程：降温至38℃，在水浴锅中进行保温，分批次加入等量的胍基丁胺酶，胍基丁胺酶的用量占精浆液的4wt％，分批次加入plp，plp的用量占精浆液的0.04wt％，过程ph用浓盐酸控制在5.5左右，得到胍基丁胺转化液。
72.3.提取方法与实施例2中的步骤(2)相同。
73.对比例4
74.与实施例2的步骤相同，区别在于：第一次分离和第二次分离得到的水洗液(母液)不回流至第一次脱色工序重复使用(即不进行母液套用)。
75.对比例5
76.与对比例3的步骤相同，区别在于：第一次分离和第二次分离得到的水洗液(母液)不回流至第一次脱色工序重复使用(即不进行母液套用)。
77.以胍基丁胺硫酸盐作为标准品配置标准溶液。将适度稀释的转化上清液和标准溶液分别与0pa衍生，经0.22um微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定胍基丁胺含量。
78.高效液相色谱条件：
79.色谱柱：acclaim 120c18(250mm
×
4.6mm
×
5um)。
80.流动相：流动相a：10mm kh，po，缓冲液(ph5.3)；流动相b：乙腈-甲醇-10mm kh，po，(体积比为5：3：1)，用0.22um滤膜过滤；
81.柱温：35℃；
82.检测波长：激发波长330nm，发射波长465nm；
83.进样量：12u1(8u1样品+4u10pa衍生剂)；
84.流速：1ml/min。
85.胍基丁胺含量的测定方法：面积法。
86.收率＝实际得到的胍基丁胺的质量/l-精氨酸完全转化成胍基丁胺的质量；
87.转化率＝胍基丁胺的质量/l-精氨酸的质量；
88.纯度＝目标产品的质量/总质量。
89.通过对实施例2和对比例1～5制备的胍基丁胺成品进行检测，其转化率和纯度见表1。
90.表1
91.项目转化率纯度收率实施例2≥99％≥98％95-98％对比例1≥99％≈60％70～75％对比例2≥99％≈50％75～80％对比例3≈65％≥98％95-98％对比例4≥99％≥98％≈55％对比例5≈65％≥98％≈48％
92.由表1可知，采用本发明的方法制备胍基丁胺，其转化率、纯度和收率均高于对比例1～5。并且本发明的方法制备胍基丁胺的成本非常低，以镍柱作为转化场所，一根镍柱从开始使用到失效，可以转化十几吨精氨酸，镍柱的使用成本仅20元/天左右，本发明的方法大大降低了胍基丁胺的生产成本。
93.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。