肺癌胸水来源类器官的培养基、培养方法及其应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种用于肺癌类器官培养的 培养基、使用该培养基培养肺癌胸水来源类器官的方法、及其在药物 的疗效评估和筛选中的应用。

背景技术：

1、肺癌是肺部常见的恶性肿瘤，对人类健康和生命威胁最大的恶性 肿瘤之一。临床研究证实肺癌发展到晚期都会出现恶性胸腔积液 (malignant pleural effusion,mpe)。mpe的出现即提示失去手术治疗 机会，表明患者预后不良。高通量药敏检测分析需要在体外分离纯化 出足够数目的病人自体肿瘤细胞，而肿瘤细胞的体外培养，一直是阻 碍肿瘤细胞药敏检测的瓶颈问题。由于晚期肺癌伴胸水的患者，其胸 水中常常富含纯度较高的肿瘤细胞，因此适合通过高通量药敏检测技 术来为病人筛选最佳治疗方案。传统临床药物敏感性检测大多采用二 维细胞培养。然而，二维培养的细胞仅在有限程度上模拟组织生理条件，缺乏体内真实的组织结构，易导致低分化水平和细胞生理功能的 丢失，进而导致获得的实验结果很难预测临床实际结果。

2、类器官，属于三维(3d)细胞培养物，主要来源于人体具有分化 能力的胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞和成体干细胞。不同组织器官 都存在内源组织干细胞，在维持各器官的功能形态发挥着重要作用。 这些干细胞在体外一定的诱导条件下，可以自组织形成一个直径仅为 几毫米的迷你结构。肿瘤类器官是用取自患者体内原发性肿瘤，在实 验室中培养出一些微型的3d肿瘤细胞模型。肿瘤类器官高度模拟了来 源肿瘤组织的特征，保留了个体之间的肿瘤异质性，可用于功能性的 测试，如进行高通量药物筛选和个体化精准治疗。当前，肺癌类器官 培养方法多采用r-spondin-1、wnt3a和noggin等昂贵的蛋白因子，导致类器官培养成本较高；且这项技术操作复杂和技术难度大，导致 其大规模商业化应用受到限制。因此，需要开发一种低成本、简单且 成功率高的类器官培养方法和培养基。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于在体外快速扩增 肺癌类器官的培养基及培养方法。

2、本发明的一个方面在于提供一种肺癌类器官的培养基，所述培养 基包含mst1/2激酶抑制剂、选自n2和b27的至少一种细胞培养添加 剂、成纤维细胞生长因子10、sb202190、y27632、a83-01、神经调节 蛋白1、胰岛素样生长因子1、角化细胞生长因子、glutamax、烟酰 胺和hepes。其中，所述mst1/2激酶抑制剂包括式(i)的化合物或 其药学可接受的盐、或溶剂化物，

3、

4、其中，

5、r1选自c1-c6烷基、c3-c6环烷基、c4-c8环烷基烷基、c2-c6 螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地r6取代的芳基(例如苯基和萘 基等)、芳基c1-c6烷基(例如苯甲基等)和杂芳基(例如噻吩基等)；

6、r2和r3各自独立地选自c1-c6烷基，优选c1-c3烷基，更优选 甲基；

7、r4和r5各自独立地选自氢、c1-c6烷基、c3-c6环烷基、c4-c8 环烷基烷基、c1-c6烷基羟基、c1-c6卤代烷基、c1-c6烷基氨基c1-c6 烷基、c1-c6烷氧基c1-c6烷基、和c3-c6杂环基c1-c6烷基(所述 杂环基选自例如哌啶基、四氢吡喃基等)；

8、r6选自卤素(优选氟和氯，更优选氟)、c1-c6烷基(优选甲基)、 c1-c6烷氧基(优选甲氧基)、和c1-c6卤代烷基(优选三氟甲基)。

9、优选的实施方式中，mst1/2激酶抑制剂包括式(ia)的化合物或其 药学可接受的盐、或溶剂化物，

10、

11、其中，

12、r1选自c1-c6烷基、任选地被1-2个独立地r6取代的苯基、任选 地被1-2个独立地r6取代的噻吩基、和任选地被1-2个独立地r6取代 的苯甲基，r1更优选为任选地被1-2个独立地r6取代的苯基；

13、r5选自氢、c1-c6烷基、和c3-c6环烷基，r5更优选为氢；

14、r6各自独立地选自卤素、c1-c6烷基、和c1-c6卤代烷基，r6更 优选为氟、甲基或三氟甲基。

15、优选地，所述mst1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的 盐、或溶剂化物中的至少一种。

16、

17、

18、

19、

20、

21、最优选地，本发明的mst1/2激酶抑制剂为化合物1。

22、在本发明的实施方式中，本发明的培养基中各成分的含量满足以 下任意一项或多项或全部满足：

23、(1)mst1/2激酶抑制剂的浓度优选为2.5～10μm；

24、(2)b27或n2细胞培养添加剂相对于培养基的体积比优选为 1:25～1:100；

25、(3)成纤维细胞生长因子10的浓度优选为25～200ng/ml；

26、(4)sb202190的浓度优选为200～1000nm；

27、(5)y27632的浓度优选为2.5～10μm；

28、(6)a83-01的浓度优选为200～1000nm；

29、(7)神经调节蛋白1的浓度优选为1～40ng/ml；

30、(8)胰岛素样生长因子1的浓度优选为2～40ng/ml；

31、(9)角化细胞生长因子的浓度优选为2～40ng/ml；

32、(10)glutamax相对于培养基的体积比优选为1:50～1:200；

33、(11)烟酰胺的浓度优选为1～10mm；

34、(12)hepes的浓度优选为1～10mm。

35、在本发明的实施方式中，所述培养基还含有选自dmem/f12、 dmem、f12或rpmi-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两 性霉素b和primocin中的一种或多种的抗生素。

36、在优选的实施方式中，当抗生素选自链霉素/青霉素时，链霉素浓 度范围为25～400μg/ml，青霉素浓度范围为25～400u/ml，当抗生 素选自两性霉素b时，浓度范围为0.25～4μg/ml，当抗生素选自 primocin时，浓度范围为25～400μg/ml。

37、本发明还提供一种肺癌类器官的培养方法。在本发明的肺癌类器 官的培养方法中，使用本发明的肺癌类器官培养基对肺癌胸水组织来 源的原代细胞进行培养。

38、本发明的肺癌类器官培养方法包括以下步骤。

39、1.从肺癌胸水组织中分离样本，获得肺癌原代细胞。该处理过程 包括以下步骤：

40、(1)分离肺癌胸水组织样本，将收集到的肺癌胸水转移至离心管 中，离心转速为1800～2200rpm，离心时间为8～12分钟；

41、(2)离心后弃去上清液，加入基础培养基重悬后过筛，收集细胞 悬液离心，离心转速为1200～1600rpm，离心时间为3～5分钟；

42、(3)观察细胞沉淀，若含红细胞，则加入3-5毫升红细胞裂解液 在冰上裂解5-10分钟，裂解完全后离心，离心转速为1200～1600rpm， 离心时间为3～5分钟，得到细胞沉淀待用。

43、其中，基础培养基配方包括选自dmem/f12、dmem、f12或 rpmi-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素b和primocin中的一种或多种的抗生素。

44、2.配制本发明的肺癌类器官培养基，并对上述步骤获得的肺癌原 代细胞进行培养。

45、将上述步骤1中获得的肺癌原代细胞用本发明的肺癌类器官培养 基重悬并计数，将细胞密度稀释为5～10×104个/ml，将细胞悬液加 入超低吸附培养板或者培养瓶中，进行扩大培养。

46、本发明还提供一种用于评估或筛选治疗肺癌疾病的药物的方法， 其包括以下步骤：

47、(1)使用本发明的肺癌类器官的培养方法培养肺癌类器官；

48、(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；

49、(3)对(1)中培养得到的类器官添加稀释后的所述药物；

50、(4)进行类器官大小或类器官活力测试。

51、本发明的有益效果包括：

52、(1)提高肺癌组织来源类器官培养的成功率，成功率达到85％以 上；

53、(2)保证体外原代培养的肺癌类器官能够保持病人的病理特性；

54、(3)扩增效率高，能快速培养出肺癌类器官，扩增出的肺癌类器 官还可以连续传代；

55、(4)培养成本可控，培养基无需加入价格昂贵的wnt激动剂、 r-spondin家族蛋白和noggin蛋白；

56、(5)所述技术养获得的肺癌类器官数量多，适合高通量筛选候选 化合物和为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。