一种截短的猪瘟病毒E2基因及其应用的制作方法

一种截短的猪瘟病毒e2基因及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程领域。


背景技术：

2.猪瘟(classical swine fever,csf)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,csfv)引起的一种高度接触性传染病，其主要特征是急性型以败血性变化为主，实质器官出血、坏死和梗死，慢性型则呈纤维素性坏死性肠炎变化。csfv基因组长约12.3kb，仅含有一个大的开放性阅读框(orf)，翻译成一种多聚蛋白，通过加工为1个结构蛋白和3个囊膜糖蛋白，即ems(e0)、e1和e2，其中e2蛋白具有很好的免疫原性，能诱导机体产生高水平的病毒中和抗体，csfv表面的单抗决定簇主要分布在e2蛋白上。因此，可将e2蛋白用于制备csfv抗体检测试剂，或者将e2蛋白用于制备csfv亚单位疫苗。
3.目前e2蛋白的表达系统有原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、cho表达系统。其中cho细胞为仓鼠卵巢细胞，属于高级哺乳动物细胞，可对表达后蛋白进行进一步的空间折叠及糖基化修饰，由于e2蛋白的糖基化程度，哺乳动物表达系统折叠修饰后的表达产物免疫原性更好。因此cho表达系统作为猪瘟e2蛋白最优的表达系统。
4.cn 107674883 a公开了一种重组猪瘟e2蛋白及其亚单位疫苗的制备方法和应用，指出e2基因(表达e2蛋白的基因)未经密码子优化，基本不能在cho细胞中表达，为提高e2基因在cho细胞的表达量，对e2基因进行密码子优化，可将e2蛋白得率提高至1g/l培养上清。


技术实现要素：

5.本发明要解决的问题是：提供一种在cho细胞内表达效率更高的e2基因，以提高e2蛋白的得率，并保持其免疫原性。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种截短的猪瘟病毒e2基因，所述e2基因是序列如seq id no.1所述的基因。
8.一种重组质粒，所述质粒含有前述截短的猪瘟病毒e2基因。
9.进一步地，所述质粒为含有前述截短的猪瘟病毒e2基因的pcho1.0质粒。
10.一种重组cho细胞，所述细胞携带前述截短的猪瘟病毒e2基因或前述的质粒。
11.前述基因、质粒或细胞在制备截短的e2蛋白的用途。
12.前述基因或其mrna、质粒或细胞在制备猪瘟病毒抗体检测试剂或猪瘟病毒疫苗中的用途。所述用途包括了将前述基因或其mrna、质粒用于制备核酸疫苗，也包括将前述基因、质粒或细胞用于表达截短的e2蛋白，进而用截短的e2蛋白制备亚单位疫苗。
13.一种截短的e2蛋白，序列如seq id no.2所示。
14.前述蛋白在制备猪瘟病毒抗体检测试剂或猪瘟病毒亚单位疫苗中的用途。
15.一种猪瘟病毒抗体检测试剂，所述试剂含有序列如seq id no.2所示的蛋白。
16.一种猪瘟病毒亚单位疫苗，所述亚单位疫苗含有序列如seq id no.2所示的蛋白。
17.本发明具有如下有益效果：
18.1)相比野生型e2基因，本发明的截短的e2基因表达效率高，可使e2蛋白得率提高到1.9mg/ml培养上清。
19.2)本发明的e2基因所表达的e2蛋白虽然为不是完整的e2蛋白，但仍保持良好的免疫原性，可用于猪瘟病毒抗体检测试剂和猪瘟病毒亚单位疫苗的生产。
20.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
21.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
22.图1：跨膜疏水区分析图。
23.图2：改造前后猪瘟e2蛋白氨基酸序列对比图。
24.图3：琼脂糖凝胶电泳鉴定pcho1.0-csfv-e2-ecd质粒酶切结果。1：marker；2：pcho1.0-csfv-e2-ecd质粒双酶切验证；3：线性化pcho1.0-csfv-e2-ecd质粒；4：pcho1.0-csfv-e2-ecd质粒。
25.图4：琼脂糖凝胶电泳鉴定pcho1.0-csfv-e2-ecd质粒酶切结果。1～10：pcho1.0-e2-ecd转化top10后单克隆；11：阴性对照；12：阳性对照。
26.图5：瞬时表达e2蛋白wb鉴定结果。1：瞬转48小时产物；2：瞬转96小时产物；3：marker。
27.图6：单克隆流加培养上清中，猪瘟e2蛋白hplc定量结果，上样量均为30μl。
28.图7：sds-page(左)、western blot(右)检测纯化后猪瘟e2蛋白。1：7.5μl洗脱液上样量；2：15μl洗脱液上样量；3：洗杂液；4：marker。
29.图8：纯化后e2蛋白的hplc结果。
具体实施方式
30.实施例1截短的猪瘟病毒e2蛋白稳转cho工程细胞系的构建以及e2蛋白真核表达
31.1 tb-g-20200701质粒的构建
32.委托金斯瑞生物合成c末端带his-tag纯化标签的猪瘟e2全长基因并克隆至pcho1.0载体的xmaji与bstz17i酶切位点，将该克隆质粒命名为tb-g-20200701。
33.2 pcho1.0-csfv-e2-ecd稳转质粒的构建及鉴定
34.通过跨膜区疏水性分析，发现e2蛋白全基因氨基酸343～365位点为跨膜疏水区(图1)。利用pcr方法截去c末端33个氨基酸对应碱基(图2)，得到截短的e2基因，序列(seq id no.1)如下：
35.atgagactgctgtgtaaggaggactaccggtacgccatctcttctactaacgagatcggacctctgggcgctgagggcctgaccaccacctggagagaatattcccacggctttcaactggacgacggcaccgtgcgggccatctgcaccgctggctccttcaaggtgatcgccctgaacgtggtgtccagaagatacctcgcttctctgcacaagcgggctctgcctaccagcgtgaccttcgagctgctgttcgacggaacctctcctgctatcgaagagatgggcgacaacttcggcttcggactgtgccctttcgacaccacacctgtggtgaaaggcaagtacaacaccacactgctgaacggctctgcctt
ctacctggtgtgtcccatcggctggaccggcgtgatcgagtgtaccgccgtgtccccaacaaccctgagaaccgaagtggtcaagacctttaagcgcgaaaagccctttcctcggagagtggactgtgtgaccaccatcgtggaaaaagaagacctgttctactgcaagtggggcggcaactggacctgcgtgaagggcaatcctgtgacctacatgggaggccaggtgaagcagtgcagatggtgcggcttcgacttcaaagagcccgatggcctgcctcactaccctatcggaaagtgcatcctggccaacgagacaggctatagagtcgtggattctactgactgcaaccgggacggtgtggtcatctccaccaagggcgagcacgagtgcctgattggcaatacaaccgttaaagtgcacgccctggatggccggctgggccctatgccttgccggcctaaggaaatcgtgtccagcgccggccccgtgcggaagacctcctgcaccttcaactacaccaagaccctgaagaacaagtactacgagccaagagactcctacttccagcagtacatgctgaagggagagtaccagtactggttcgatctggacgccaccgaccaccacaccgattacttcgcccaccaccatcaccaccat
36.对应的蛋白产物(本发明的e2蛋白)，序列(seq id no.2)如下：
37.mrllckedyryaisstneigplgaegltttwreyshgfqlddgtvraictagsfkvialnvvsrrylaslhkralptsvtfellfdgtspaieemgdnfgfglcpfdttpvvkgkynttllngsafylvcpigwtgviectavspttlrtevvktfkrekpfprrvdcvttivekedlfyckwggnwtcvkgnpvtymggqvkqcrwcgfdfkepdglphypigkcilanetgyrvvdstdcnrdgvvistkgeheclignttvkvhaldgrlgpmpcrpkeivssagpvrktsctfnytktlknkyyeprdsyfqqymlkgeyqywfdldatdhhtdyfahhhhhh
38.截短后的序列通过同源重组的方式重新构建进入pcho1.0质粒，成功构建含有截短后e2基因的pcho1.0质粒，命名为pcho1.0-csfv-e2-ecd；构建的pcho1.0-csfv-e2-ecd质粒经双酶切验证可得到1109bp条带，经基因测序与截短后的序列一致(图4)。
39.3 pcho1.0-csfv-e2-ecd质粒的转化及阳性克隆的筛选
40.将pcho1.0-csfv-e2-ecd转化进入top10感受态，通过卡那抗生素筛选及pcr鉴定的方式得到两个阳性克隆(图4)。
41.4 pcho1.0-csfv-e2-ecd线性质粒的转染及瞬转产物的鉴定
42.挑取阳性克隆摇菌进行质粒大提，并将提取的质粒进行线性化，得到浓度为1.3μg/ml核酸26μg。通过脂质体转染方式得到瞬时转染细胞系，取该细胞系48小时培养上清与wh303单抗(e2蛋白的特异性单抗)进行western blot鉴定，可在55kda处有特异性结合条带(图5)。
43.5猪瘟病毒e2蛋白重组cho工程细胞株构建及表达e2蛋白的纯化鉴定
44.5.1稳转细胞系筛选
45.转染48小时后，取细胞计数，按照1.0
×
106cells/ml细胞密度，15ml加压至t75方瓶中，加压培养基为20p200m压力的cd forticho medium(含4mm l-glutamine+0.5％anti-clumping agent+20μg/ml puromycin+200nm mtx)，37℃，5％co2，80％湿度，静置培养。静置培养9天后，取细胞计数，按照3
×
105cells/ml细胞密度，30ml传代至125ml摇瓶中，传代培养基为20p200m压力的cd forticho medium。37℃，5％co2，80％湿度，120rpm振荡培养。
46.每两天用20p200m压力的cd forticho medium传代直至细胞活率升至90％以上时，进行第二轮加压，将细胞传代至50p1000m压力的cd forticho medium(含4mm l-glutamine+0.5％anti-clumping agent+50μg/ml puromycin+1μm mtx)，通过连续传代，细胞活率恢复至96％，对稳转细胞系进行冻存，得到10支冻存细胞(1.5
×
107个/ml，1ml/支)，梯度降温后于液氮保存。
47.5.2单克隆细胞筛选
48.于液氮罐中取出5.1冻存的稳转细胞系，用有限稀释法法稀释至0.5cells/ml细胞密度，铺至96孔板，于二氧化碳培养箱静置培养18天后，取上清用elisa方法检测上清中e2蛋白表达量，将表达量相对较高的克隆扩大至24孔板。再用同样方法，依次扩大至6孔板、125ml摇瓶，最终获得9个表达量相对较高的单克隆细胞，并分别冻存10支细胞(1.5
×
107个/ml，1ml/支)，梯度降温后于液氮保存。
49.5.3单克隆细胞e2蛋白表达量检测和纯化
50.利用流加培养的方式对9个单克隆细胞进行培养及猪瘟e2蛋白的表达，其中表达第3、5、7、9、11、13、15天，分别向培养体系中加入4％cell boost7a/0.4％cell boost 7b补料，培养第16天，离心收集培养上清，用hplc方法对上清中e2蛋白定量(图6)，表达量最高的3d6单克隆为1.9mg/ml。取表达量最高的3d6单克隆培养上清，利用镍亲和层析对收集上清进行纯化，上样8ml，用含500mm咪唑的缓冲液洗脱蛋白，并用10kda大小的超滤管超滤蛋白，去除咪唑，最终得到蛋白液10ml。
51.6纯化后e2蛋白的体外鉴定及检测
52.利用sds-page及western blot对纯化后的e2蛋白进行体外鉴定，在55kda处均有特异性条带出现(图7)，sds结果可以看出纯化后蛋白纯度＞90％；紫外法检总蛋白含量为1.3mg/ml；hplc结果显示纯化后e2蛋白的纯度可达到98.8％，保留时间为17分钟(图8)，可满足后期免疫原性实验及检测标准品要求。
53.7纯化后e2蛋白的免疫原性鉴定
54.将纯化定量后的蛋白与水包油包水佐剂制成乳化苗(猪瘟e2蛋白20μg/ml)。筛选3～4周龄猪瘟抗原抗体阴性仔猪10头，随机分为2组，每组5头；第一组颈部肌肉注射e2蛋白乳化苗2ml，第二组不接种作为对照。免疫后21日，测定血清中和抗体效价及elisa抗体阻断率。
55.结果如表1所示，免疫后21日elisa抗体阻断率可达70％以上，血清中和抗体效价可到1:64。可见，本发明的猪瘟e2蛋白的免疫原性较好。
56.表1猪瘟e2蛋白免疫仔猪21日后elisa抗体及血清中和效价结果
[0057][0058]
备注：猪瘟elisa抗体阻断率≤30判定为阴性，≥40判定为阳性，30＜阻断率＜40，判定为可疑。
[0059]
鉴于本发明e2基因的高表达效率和产物的高免疫原性，还可将e2基因或其mrna用于制备猪瘟核酸疫苗，令其在猪体内表达具有免疫原性的e2蛋白，激活猪的免疫应答，提供保护作用。
[0060]
除了用于制备疫苗，本发明的e2蛋白因为具有良好的免疫原性，能和e2蛋白的抗体特异性结合，还能用于制备猪瘟病毒e2蛋白抗体的检测试剂。
[0061]
综上，本发明的e2基因表达效率高，可用于体外产业化制备e2蛋白，也可用于核酸疫苗、亚单位疫苗等疫苗，还能用于制备猪瘟病毒e2蛋白抗体的检测试剂，应用前景良好。