一种重组新冠肺炎病毒中和抗体的生产及放大工艺的制作方法

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种动物细胞培养方法，特别涉及一种基于生产抗体的重组cho细胞培养和扩大培养平台的重组新冠肺炎病毒中和抗体的生产及放大工艺。

背景技术：

1、新型冠状肺炎病毒(新冠病毒，下同)中和抗体是针对新冠病毒开发的生物药，用于新冠病毒引起的疫情，降低死亡率，相比小分子抗病毒药物，中和抗体特异性高，且可以更好的预防病毒感染。目前，针对新冠病毒的中和抗体包括新冠病毒重组人抗体sars-cov/sars-cov-2s、新冠病毒ecd重组人抗体sars-cov-2s ecd、新冠病毒单克隆抗体sars-cov-2s等(huang yang,sun hui,yu hai,li shaowei,zheng qingbing,xianingshao.neutralizing antibodies against sars-cov-2:current understanding,challenge and perspective.[j].antibody therapeutics,2020,3(4).)。由于新冠中和抗体是新的靶点，缺乏参考工艺，且其制剂剂量高，对时间要求紧迫，所以要求我们的细胞培养工艺有更高的表达量，开发出一种成熟的细胞培养开发及放大平台化的方法。

2、现有方法往往通过cho细胞小规模培养的工艺进行研究，找出其细胞培养的工艺关键参数，并进行科学的从5l放大至200l培养规模，锁定工艺后进行至少三批的连续生产确认，能够证明放大后的工艺与原有工艺质量一致，蛋白表达量不低于原工艺水平，批次产量增加数倍，为cho细胞培养放大的工业化生产提供支持。通过对工艺的放大研究，成功的将细胞培养规模从5l放大至200l，但是其基于传统的放大流程，摸索小规模工艺条件，从5l放大至200l规模，后续需放大至2000l规模仍需进行相应的研究和验证，耗费时间较长。

技术实现思路

1、本发明建立一套平台化的新冠病毒细胞培养工艺开发及放大的方法，快速确定细胞培养开发工艺及放大方法。具体而言，一方面，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，将抗体种子细胞持续扩增。

2、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，所述扩增为将种子细胞经过三次反应器生产培养后，培养体积扩增超过2100倍。

3、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，所述扩增为将种子细胞经过三次反应器生产培养后，培养体积扩增超过2100倍。

4、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，所述扩增为将种子细胞经过三次反应器生产培养后，培养体积由550ml扩增至1200l。

5、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，所述三次反应器为wave反应器生产培养、xdr500反应器生产培养和xdr2000反应器生产培养。

6、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，所述xdr2000反应器生产培养过程中需调整温度。

7、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，所述调整温度为培养至第3天时将温度由37.0℃调整至34.0℃。

8、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，所述wave反应器培养过程中需调整转速。

9、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，所述调整转速为培养至第3天时将转速由15rpm调整至20rpm。.

10、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，所述wave反应器培养过程中需要补加培养基。

11、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，所述补加培养基为培养至第3天时补加20kg的mc01基础培养基。

12、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，所述细胞从摇瓶向wave反应器扩增后，细胞体积由550ml到5l，所述wave反应器培养第3天后细胞体积由5l扩增至25l，所述细胞从wave反应器向xdr500反应器扩增后细胞体积由25l扩增至200l，所述细胞从xdr500反应器向xdr2000反应器扩增后细胞体积由200l扩增至1200l。

13、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺，其特征在于，在三次反应器生产培养后进行碟片式离心和深层过滤。

14、进一步，本发明提供一种重组抗体的生产及放大工艺在制备重组新冠肺炎病毒中和抗体中的应用。

15、为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

16、在此使用的术语“培养基”和“细胞培养基”指的是含有滋养生长的动物细胞，例如，哺乳动物细胞的养分的溶液，并且也指的是与细胞结合的培养基。

17、优选的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(cho)细胞。本领域技术人员周知通过基因工程改造的细胞和/或细胞系表达感兴趣的蛋白质的方法和载体。基因工程技术包括，但不限于表达载体、定向同源重组和基因激活。可选地，该蛋白质在异源调控元件，比如，在自然界中不引导多肽生产的启动子，的控制下表达。例如，该启动子可以为引导哺乳动物多肽表达的病毒型强启动子(例如，cmv，sv40)。该宿主细胞通常可以或不可以生产蛋白质。例如，该宿主细胞可以为cho细胞，该cho细胞通过基因改造产生蛋白质，意味着编码该蛋白质的核酸已经导入该cho细胞中。

18、在此使用的术语“抗体”包括抗体或抗体衍生物，或其片段，并且抗体的说明也适用于本发明的抗体的制备。在抗体的片段中，功能相当或同源的抗体包括含有免疫球蛋白结合结构域的多肽或摹拟该结合结构域，以及fc区或与fc区或至少部分fc区同源的区的肽。也包括与另一多肽融合的、含有免疫球蛋白结合结构域，或等同物的嵌合分子。

19、典型的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子含有抗体决定簇的部位，包括被称为fab、fab'、f(ab')2、fc和f(v)，以及n-多糖结构的这些部位。抗体描述了血清的功能成分并且通常指的是许多分子(抗体或免疫球蛋白，片段等等)或一种分子(抗体分子或免疫球蛋白分子)。抗体分子能与特定的抗原决定簇(抗原或抗原表位)结合或反应，这反过来可以诱导免疫效应机制。单独的抗体分子通常被看成是单一特异性的并且抗体分子的组合物可以是单克隆的(即，由相同的抗体分子组成)或多克隆的(即，由与相同抗原上或有差别的不同的抗原上相同或不同表位反应的不同的抗体分子组成)。组成多克隆抗体的差别的和不同的抗体分子可以称为“成员”。每种抗体分子具有能使其特异性结合至该分子相应的抗原的唯一的结构，并且所有的天然抗体分子具有两条相同的轻链和两条相同的重链的相同的整体基本结构。

20、本发明取得了以下有益的技术效果：

21、首先，本发明的生产工艺是基于抗体生产过程中长期的积累的重组cho细胞培养方法建立的标准化平台性技术，在新冠肺炎病毒中和抗体生产中的具体应用。无需对放大培养各阶段的条件和参数进行具体优化，直接采用标准化平台固定的条件进行生产，显著缩短了工艺开发周期。

22、其次，本发明大规模生产新冠肺炎病毒中和抗体的方法，其中用于生产新冠肺炎病毒中和抗体重组cho细胞，与建立重组cho细胞培养标准化平台所针对的细胞和重组质粒系统均完全相同、区别仅在于所表达抗体的特异性不同。因此将重组cho细胞培养标准化平台应用于新冠肺炎病毒中和抗体的生产能够确保抗体的生产效率和活性。

23、另外，重组cho细胞培养标准化平台技术各操作步骤之间的参数稳定性、不同批次之间的工艺一致性、以及生产效率已经得到反复验证和优化。因此，采用标准化平台技术确定新冠肺炎病毒中和抗体生产工艺能够确保新冠肺炎病毒中和抗体质量稳定，同时能充分利用细胞和培养基资源确保生产高效。