一种启动子及其在上调目的基因的转录表达上的应用的制作方法

本发明涉及基因工程，具体涉及一种启动子及其在上调目的基因的转录表达上的应用。

背景技术：

1、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物降解能力弱的特性。作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产多种氨基酸、核苷酸及其他有机酸。

2、谷氨酸棒杆菌用于生产氨基酸的历史可追溯到20世纪60年代，谷氨酸棒杆菌可以在自然环境下生产谷氨酸，诱变的谷氨酸棒杆菌还可以生产赖氨酸、缬氨酸等多种氨基酸。随着代谢工程技术和基因组测序技术的快速发展，对谷氨酸棒杆菌的代谢路径研究越来越清晰，研究者们陆续鉴定到很多遗传学上的高产机理，并实现了多种代谢产物的高效生产。

3、对于氨基酸的高效生产，可通过很多途径来实现，比如解除产物的反馈抑制，强化末端合成途径的关键酶，强化辅因子供应，优化中央代谢的碳流分配，及阻断竞争支路等。对于基因的强化表达，传统的策略有引入基因的多个拷贝，或用已知的强启动子替换目的基因的天然启动子。通用的谷棒内源强启动子有编码超氧化物歧化酶基因的启动子，和编码延伸因子的启动子。然而，这些通用启动子由于数量有限，表达强度固定，远远不能满足基因工程技术研发人员对启动子的需求。此外，启动子的表达强度，除了与核心区的碱基序列有关，其上下游的碱基序列及长度，对基因的表达也有显著的影响，这与基因的复杂调控机理有关。因此，不断开发新的启动子，应用于特定代谢路径的特定基因的表达调控是十分必要的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种新型启动子，该启动子核酸序列通过可操作地连接到目标基因上，进而上调目标基因的转录表达，从而提升相应功能。

2、具体地，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种启动子，其具有如seq id no：17所示的核苷酸序列。

4、本发明提供了一种新型启动子，其能上调目标基因的转录表达，当将其可操作地连接到赖氨酸合成相关基因上，可促进赖氨酸的高效生产。

5、本发明所述的启动子是指位于编码区上游的非翻译核酸序列，该序列至少包含rna聚合酶结合位点，并且具有启动下游基因转录成mrna的活性。该序列中还常常包括一段5’非翻译区，该区域是某些转录因子或调控因子的结合区域。

6、第二方面，本发明提供一种表达载体，其包括上述启动子。

7、第三方面，本发明提供一种dna分子，其包括编码赖氨酸外运蛋白的基因和连接于所述基因的上游区域的启动子，和/或，编码丙酮酸羧化酶的基因和连接于所述基因的上游区域的启动子；所述启动子如上所述。

8、第四方面，本发明提供上述启动子或表达载体或dna分子在以下一个或多个方面上的应用：

9、(1)上调目的基因的转录表达，优选所述目的基因为赖氨酸合成相关基因；

10、(2)提高微生物的氨基酸产量，优选所述氨基酸为赖氨酸；

11、(3)提高微生物的糖酸转化率。

12、第五方面，本发明提供一种重组微生物，其包括上述启动子或表达载体或dna分子。

13、本发明的重组微生物，其出发菌为谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)。

14、第六方面，本发明提供一种制备上述重组微生物的方法，其包括：将上述启动子或表达载体引入宿主细胞中的步骤，优选，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)。

15、第七方面，本发明提供上述重组微生物在生产氨基酸中的应用，优选所述氨基酸为赖氨酸。

16、第八方面，本发明提供一种提高微生物赖氨酸产量和/或糖酸转化率的方法，具体将编码赖氨酸外运蛋白的基因和/或丙酮酸羧化酶的基因处于上述启动子的控制之下。

17、第九方面，本发明提供一种生产赖氨酸的方法，其包括对上述重组微生物进行发酵培养的步骤。

18、本发明具体以一株赖氨酸生产菌cgmcc no.11942为实施对象，用该新型启动子替换赖氨酸外运蛋白编码基因的天然启动子，改造后的菌株具有更高效的赖氨酸外运能力。为了进一步验证该启动子的效果，本发明继续以另外一株赖氨酸生产菌cgmcc no.13407为实施对象，用该新型启动子异位表达丙酮酸羧化酶，后者是赖氨酸合成相关的重要基因，改造后的菌株具有显著的转化率提升效果。

19、本发明的有益效果在于：

20、本发明提供了一种新型的人工合成启动子。该启动子与已知的强启动子相比，具有更高的表达活性。可通过将上述新型启动子核酸序列可操作地连接到目的基因的上游区域，实现对目的基因的转录表达上调，表达水平优于其天然启动子的作用，从而可提升相应功能。将该启动子应用于调控赖氨酸的代谢路径，具有明显的改善效果。

技术特征：

1.一种启动子，其特征在于，具有如seq id no：17所示的核苷酸序列。

2.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的启动子。

3.一种dna分子，其特征在于，包括编码赖氨酸外运蛋白的基因和连接于所述基因的上游区域的启动子，和/或，编码丙酮酸羧化酶的基因和连接于所述基因的上游区域的启动子；所述启动子如权利要求1所述。

4.权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的表达载体或权利要求3所述的dna分子在以下一个或多个方面上的应用：

5.一种重组微生物，其特征在于，包括权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的表达载体或权利要求3所述的dna分子。

6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的出发菌为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)。

7.一种制备权利要求5或6所述的重组微生物的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的表达载体引入宿主细胞中的步骤，优选，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)。

8.权利要求5或6所述的重组微生物在生产氨基酸中的应用，优选所述氨基酸为赖氨酸。

9.一种提高微生物赖氨酸产量和/或糖酸转化率的方法，其特征在于，将编码赖氨酸外运蛋白的基因和/或丙酮酸羧化酶的基因处于权利要求1所述的启动子的控制之下。

10.一种生产赖氨酸的方法，其特征在于，包括对权利要求5或6所述的重组微生物进行发酵培养的步骤。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种启动子及其在上调目的基因的转录表达上的应用。本发明的启动子具有如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。该启动子与已知的强启动子相比，具有更高的表达活性。可通过将其可操作地连接到目的基因的上游区域，实现对目的基因的转录表达上调，表达水平优于其天然启动子的作用，从而可提升相应功能。将该启动子应用于调控赖氨酸的代谢路径，具有明显的改善效果。

技术研发人员：胡丹,王亚迪,赵津津,李岩
受保护的技术使用者：冯波
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15