地衣芽孢杆菌BLc06及其制备的功能型瓜果育苗生物基质和应用

地衣芽孢杆菌blc06及其制备的功能型瓜果育苗生物基质和应用
技术领域
1.本发明涉及农业微生物应用技术领域，具体涉及地衣芽孢杆菌blc06及其制备的功能型瓜果育苗生物基质和应用。


背景技术：

2.近年来，人口数量的增长和生活质量的提升，农副产品，尤其瓜果蔬菜类作物，需求量剧增。为实现农副产品产量的增长，化学肥料的用量日渐加量。化学肥料的滥用使得农业生产成本增加，降低农产品效益价值；另外，其残留物使农田环境污染问题日渐突出，某些化学物质甚至随着食物链进而威胁到人类健康。为改变这种不良现象，探寻新的微生物菌肥替代或部分替代化学肥料的研究备受关注。
3.番茄和黄瓜作为广受大家喜爱的瓜果蔬菜，在市场需求量有增无减。番茄和黄瓜的种植面积越来越大，而保护地化肥的过量施用使得番茄和黄瓜的产量和质量严重降低，进而对番茄和黄瓜的生产造成很大的经济损失和保护地资源的浪费，并且施用过程中会造成对环境的二次污染，因此急需开发出新型高效的微生物育苗生物基质。


技术实现要素：

4.针对施加化学肥料易出现化学药品的不规范使用或超过使用标准导致的食品安全隐患问题和环境污染问题，本发明提供地衣芽孢杆菌blc06及其制备的功能型瓜果育苗生物基质和应用，该地衣芽孢杆菌blc06能够定殖在植物根围，制备的功能型瓜果育苗生物基质对茄科植物(番茄)、葫芦科植物(黄瓜)的生长具有明显促生作用，应用可节约大量成本，使瓜果蔬菜生产效益最大化，对经济植物的栽培具有重大应用价值。
5.第一方面，本发明提供地衣芽孢杆菌blc06，所述地衣芽孢杆菌blc06已于2021年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23373，分类命名为地衣芽孢杆菌bacillus licheniformis。
6.第二方面，本发明提供一种使用地衣芽孢杆菌blc06制备的功能型瓜果育苗生物基质。
7.进一步的，所述功能型瓜果育苗生物基质由普通果蔬育苗基质中添加地衣芽孢杆菌blc06得到。
8.进一步的，以普通育苗基质干重计，所述普通育苗基质中有机质含量≥45％，腐殖酸含量≥15％，总养分(n+p2o5+k2o)含量为1.5％～7.0％，ph值为5.5～6.8，游离水含量≤43％，ec≤2.5ms/cm。
9.进一步的，以功能型瓜果育苗生物基质干重计，所述功能型瓜果育苗生物基质中有益活菌数≥4.0
×
107cfu/g，有机质含量≥38％，总养分(n+p2o5+k2o)含量为1.0％～6.0％，ph值为5.5～7.0，游离水含量≤38％，ec≤2.5ms/cm。
10.进一步的，所述功能型瓜果育苗生物基质的制备方法包括如下步骤：
11.(1)将地衣芽孢杆菌blc06菌株接种至lb固体培养基，30℃
±
1℃条件下培养，挑取单一菌落，接种于lb液体培养基，于30℃
±
1℃条件下培养至对数生长期，获得种子液，所述种子液浓度不低于1.0
×
108cfu/ml；
12.(2)将种子液以体积比1：10的接种量接种至发酵培养基，使发酵培养体系中菌体初始浓度达到1.0
×
107cfu/ml，发酵条件为：在30℃
±
1℃条件下，通气保压0.08～0.1mpa，溶氧量28％～32％，转速180～200r/min，发酵过程中保持发酵液ph7.2～7.5，培养38～48h后测量活菌总量，芽孢产孢率不低于92％，使发酵液中含菌或芽孢量计数浓度达到2.0
×
10
10
cfu/ml，发酵结束，获得发酵液；
13.(3)将步骤(2)获得的发酵液，按照0.2kg/l添加硅藻土，充分混匀，进行喷雾干燥，得到粉状预制剂；
14.(4)取96～98份粉状预制剂、0.5～1份草炭土、0.5～1份羧甲基纤维素钠、0.5～1份壳聚糖和0.5～1份木质素硫酸钠充分混合，通过气流粉碎机，将混合物粉碎至φ＝45μm以下，获得可湿性粉剂，所述可湿性粉剂中含菌或芽孢量计数浓度达到1.0
×
109cfu/g；
15.(5)将可湿性粉剂加入普通育苗基质中，接入量为8～12％(v/v)，即得功能型瓜果育苗生物基质。
16.进一步的，所述发酵培养基中含有0.1g/l蛋白胨、0.1g/l氯化钠、0.1g/l酵母粉、0.02g/l氯化钙、0.01g/l硫酸镁、0.02g/l磷酸氢二钾、0.015g/l磷酸二氢钾、5
×
10-5
g/l硫酸亚铁，所述发酵培养基ph为7.0～7.5；
17.所述发酵培养基在0.1mpa下，连同发酵罐一起115℃灭菌60min，自然冷却到常温。
18.第三方面，本发明还提供一种以地衣芽孢杆菌blc06制备的功能型瓜果育苗生物基质在茄科植物、葫芦科植物育苗上的应用。
19.进一步的，所述茄科植物为番茄。
20.进一步的，所述葫芦科植物为黄瓜。
21.本发明的有益效果在于，本发明提供的地衣芽孢杆菌blc06及其制备的功能型瓜果育苗生物基质与市场化学肥料相比，促进植物生长效果良好，对工厂化育苗中的植物的促生效果皆达到30％以上，壮苗指数上升均超过40％，在设施农业使用中结实率均不低于85％；本发明提供的功能型瓜果育苗生物基质制备方法简单，易操作，田间施用方便，对经济植物的栽培具有重大应用价值。
具体实施方式
22.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
23.实施例1地衣芽孢杆菌blc06的分离和鉴定
24.取黄瓜茎基部以下的主根和分生根部分，用75％酒精清洗30s，用无菌水反复冲洗5次，室温自然干燥后，切成长约3cm小段，称取干重10g植物根于盛有90ml无菌水的三角瓶内，在30℃、180r/min条件下的摇床中振荡20min，制成黄瓜根系菌群悬浮液，稀释成10-1
、
10-2
、10-3
、10-4
、10-5
等不同梯度稀释液后涂lb固体平板，恒温培养箱30℃，暗培养18h，后挑取单菌落。经lb固体平板纯化2次后，共挑选150株分离细菌，分别测定各菌株产植物生长素吲哚乙酸(方法参考文献：glickmann e,dessaux y.a critical examination of the specificity of thesalkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria[j].applied and environmental microbiology，1995，612)、产acc脱氨酶的能力(方法参考文献：glick br.modulation of plant ethylene levels by the bacterial enzyme acc deaminase[j].fems microbiology letter，2005，251：1-7)、解磷能力(钼锑抗分光光度法，方法参考文献：周婷.富营养化湖泊底泥中解磷菌的筛选及解磷影响因素的研究[d].长沙：湖南农业大学，2011)和固氮能力(方法参考文献：环境保护部.水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法：hj636-2012[s].天津：中国环境科学出版社，2012)。经初筛和复筛，获得一株同时产iaa，具有优异的acc脱氨酶能力和解磷固氮能力的菌株blc06，保存留待进一步研究。
[0025]
菌株blc06在lb固体平板上的单菌落呈乳白色，边缘不齐，具有黏性。革兰氏染色呈阳性，菌体着色均匀，呈两端钝平的杆状，多数菌体连接成串，呈不规则形状。对其生理生化测定，其中淀粉水解反应﹑v.p反应﹑接触酶反应﹑柠檬酸盐反应﹑石蕊牛奶还原反应﹑甲基红反应﹑d-果糖﹑麦芽糖﹑阿拉伯糖﹑木糖﹑乳糖利用均呈阳性，同时发酵葡萄糖产酸不产气，厌氧条件下不生长。
[0026]
菌株blc06进行细菌16s rdna扩增﹑测序和分析。与地衣芽孢杆菌bacillus licheniformis模式菌相似性在99％以上，结合生理生化试验将blc06鉴定为地衣芽孢杆菌。将地衣芽孢杆菌blc06在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23373，保藏日期为2021年9月8日。
[0027]
实施例2一种含有地衣芽孢杆菌blc06的功能型瓜果育苗生物基质
[0028]
(1)将-80℃保存的地衣芽孢杆菌blc06菌株接种至lb固体培养基，30℃
±
1℃条件下培养18h或过夜培养，挑取单一菌落，接种于lb液体培养基，于30℃
±
1℃条件下培养至对数生长期，获得种子液，种子液浓度不低于1.0
×
108cfu/ml。
[0029]
(2)将种子液以体积比1：10的接种量接种至发酵培养基，使发酵培养体系中菌体初始浓度达到1.0
×
107cfu/ml，发酵条件为：在30℃
±
1℃条件下，通气保压0.08～0.1mpa，溶氧量28％～32％，转速180～200r/min，发酵过程中保持发酵液ph7.2～7.5，培养48h后测量活菌总量，芽孢产孢率不低于92％，使发酵液中含菌或芽孢量计数浓度达到2.0
×
10
10
cfu/ml，发酵结束，获得发酵液；
[0030]
其中发酵培养基的制备方法为：每1000ml水加入蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉10g、氯化钙2g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸亚铁0.05g，发酵培养基ph为7.2，在0.1mpa连同发酵罐一起115℃灭菌60min，自然冷却到常温，待发酵使用。
[0031]
(3)将发酵液，按照0.2kg/l添加硅藻土，充分混匀，进行喷雾干燥，得到粉状预制剂。
[0032]
(4)取98份粉状预制剂、0.5份草炭土、0.5份羧甲基纤维素钠、0.5份壳聚糖和0.5份木质素硫酸钠充分混合，通过气流粉碎机，将混合物粉碎至φ＝45μm以下，即获取可湿性粉剂，其含菌或芽孢量计数浓度达到1.0
×
109cfu/g；半年后活菌计数浓度不低于5.0
×
108cfu/g。
[0033]
(5)将可湿性粉剂分别以5％、8％、12％的接入量接至普通育苗基质(市售)中，以普通育苗基质干重计，该普通育苗基质满足：有机质含量≥45％，腐殖酸含量≥15％，总养分(n+p2o5+k2o)含量为1.5％～7.0％，ph值为5.5～6.8，游离水含量≤43％，ec≤2.5ms/cm；混合拌匀，得到三种功能型瓜果育苗生物基质。
[0034]
采用选择性培养基法对5％blc06组、8％blc06组和12％blc06组中地衣芽孢杆菌blc06计数。选择性培养基的制备方法为：将蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、nacl 10.0g、琼脂15g、去离子水1000ml混合后，调节ph值至7.2，121℃，高压灭菌21min；待选择性培养基冷却至50℃左右，加入2％多粘菌素1ml、4％放线菌酮1ml到选择性培养基，凝固后待用。
[0035]
以功能型瓜果育苗生物基质干重计算，经计数分别含有5.0
×
107cfu/g、8.0
×
107cfu/g和12.0
×
107cfu/g地衣芽孢杆菌blc06。
[0036]
实施例3黄瓜育苗试验
[0037]
以实施例2制备的三种功能型瓜果育苗生物基质依次作为5％blc06组、8％blc06组和12％blc06组；以直接使用实施例2同种普通育苗基质为阴性对照；以向实施例2同种普通育苗基质中添加氮磷钾复合肥(使用量为60g/m2，氮：磷：钾＝1：0.4：1.6)的处理组为阳性对照组。
[0038]
将黄瓜种子(园丰元6号)消毒浸种催芽，每组处理30株，重复3遍。15d后观察统计株高﹑茎粗﹑整株干重和壮苗指数，壮苗指数的计算公式为：壮苗指数＝茎粗(cm)/株高(cm)
×
整株干重(g)。试验结果见表1，结果显示，相较阴性对照，使用添加地衣芽孢杆菌blc06的基质对园丰元6号的株高﹑茎粗﹑整株干重和壮苗指数均有显著增长，尤以8％blc06组效果最优，其生物量积累增长达到46.74％，壮苗指数增长72.73％；另外8％blc06组和12％blc06组对园丰元6号的促生效果优于/或等于阳性对照。
[0039]
表1不同育苗基质的黄瓜育苗效果
[0040] 阴性对照阳性对照5％blc06组8％blc06组12％blc06组株高（cm)14.43
±
0.6215.22
±
1.2715.23
±
1.3215.27
±
1.1015.14
±
1.03茎粗(mm)1.72
±
0.111.95
±
0.131.91
±
0.102.09
±
0.102.06
±
0.07整株干重(g)0.92
±
0.111.30
±
0.151.30
±
0.141.35
±
0.111.33
±
0.11壮苗指数0.011
±
0.00210.017
±
0.00180.017
±
0.00100.019
±
0.00100.018
±
0.0012
[0041]
稀释涂布计数各处理中地衣芽孢杆菌blc06在根际的定殖数量。5％blc06组、8％blc06组和12％blc06组所育黄瓜种苗根际含有地衣芽孢杆菌blc06的数量分别为5.4
×
106cfu/g、9.1
×
106cfu/g和1.3
×
107cfu/g。
[0042]
综上结论，最终以8％的接入量为用于黄瓜育苗时最终产品的加入量。
[0043]
实施例4番茄育苗试验
[0044]
以实施例2制备的三种功能型瓜果育苗生物基质依次作为5％blc06组、8％blc06组和12％blc06组；以直接使用实施例2同种普通育苗基质为阴性对照；以向实施例2同种普通育苗基质中添加氮磷钾复合肥(使用量为60g/m2，氮：磷：钾＝1：0.4：1.6)的处理组为阳性对照组。
[0045]
将番茄种子(中研100)消毒浸种催芽，每组处理30株，重复3遍。15d后观察统计株高﹑茎粗﹑整株干重和壮苗指数，壮苗指数的计算公式为：壮苗指数＝茎粗(cm)/株高(cm)
×
整株干重(g)。试验结果见表2，结果显示，相较阴性对照，使用添加地衣芽孢杆菌blc06的基质对中研100的株高﹑茎粗﹑整株干重和壮苗指数均有显著增长，尤以12％blc06组效果最优，其生物量积累增长达到30.38％，壮苗指数增长44.44％；另外，添加量大于8％时，处理组对中研100的促生效果优于/或等于阳性对照。
[0046]
表2不同育苗基质的番茄育苗效果
[0047] 阴性对照阳性对照5％blc06组8％blc06组12％blc06组株高(cm)16.03
±
0.7717.12
±
1.0117.06
±
1.8918.21
±
1.1718.56
±
1.38茎粗(mm)1.90
±
0.102.01
±
0.052.00
±
0.112.17
±
0.102.21
±
0.08整株干重(g)0.79
±
0.110.98
±
0.100.98
±
0.171.02
±
0.181.03
±
0.13壮苗指数0.009
±
0.00110.011
±
0.00180.011
±
0.01210.012
±
0.00110.013
±
0.0015
[0048]
稀释涂布计数各处理中地衣芽孢杆菌blc06在根际的定殖数量。5％blc06组、8％blc06组和12％blc06组所育番茄苗根际含有地衣芽孢杆菌blc06的数量分别为4.8
×
106cfu/g、8.9
×
106cfu/g和1.1
×
107cfu/g。
[0049]
综上结论，最终以12％的接入量为用于番茄育苗时最终产品的加入量。
[0050]
实施例5功能型育苗生物基质对黄瓜和番茄的田间应用
[0051]
使用不同育苗基质分别育黄瓜(元丰园6号)和番茄(中研100)种苗，待种苗长至两叶一心期，移栽至设施大棚中进行田间实验。
[0052]
试验地点：山东省济南市董家村3年龄黄瓜大棚和3年龄番茄大棚；
[0053]
试验时间/气候：2021年4月，试验期间平均温度28℃、土壤湿度为65％～90％；
[0054]
试验准备：设施地土壤栽植前彻底清除杂草、整地；开沟宽40cm，深40cm用以添加供试基质；
[0055]
供试基质：以实施例2制备的接入量为8％、12％的功能型瓜果育苗生物基质依次作为8％blc06组和12％blc06组；以直接使用实施例2同种普通育苗基质为阴性对照；以向实施例2同种普通育苗基质中添加氮磷钾复合肥(使用量为60g/m2，氮：磷：钾＝1：0.4：1.6)的处理组为阳性对照。
[0056]
用暗水法定植，每处理0.05亩，3次重复，各小区留2行保护行；缓苗定植后，田间栽培管理按当地最佳措施进行，复合肥田间应用方法参考中华人民共和国行业标准(ny/t5105-2002)中规定的黄瓜和番茄生产技术规程方法和要求；在生长周期，每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查30株，记录调查对象的生长情况，移栽21d后观察统计株高﹑茎粗；待结实收获后，统计平均粒果重量﹑座果率﹑统计产量并换算为亩产，座果率计算公式为：座果率(％)＝(果实数/开花数)
×
100％。
[0057]
试验结果见表3、表4，结果表明，相比于普通育苗基质，添加地衣芽孢杆菌blc06的育苗基质能增加植株的株高和茎粗，在作物产量上也均达到显著差异水平。尤以8％blc06组效果最优，其株高增长超过26％，茎粗增长超过20％，亩产增量5％以上，座果率超过85％。综上结论，最终以8％的接入量为用于田间生产时最终产品的加入量。
[0058]
表3不同育苗基质对黄瓜和番茄的田间生长促生效果
[0059][0060]
表4不同育苗基质对黄瓜和番茄的产量影响
[0061][0062]
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。